相对定量实验方法与数据分析

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1、相对定量实验方法与数据分析相对定量实验方法与数据分析 -CT法为例 林天时 柏业贸易（上海）有限公司 021-5080-1191/0969-802021-5080-1191/0969-802 内容内容 1.相对定量实验所需材料 2.荧光定量PCR的实验过程 2.1.引物/探针设计 2.2.核酸制备 2.3.试剂配制 2.4.PCR循环设计 2.5.样品孔设计 3.数据分析 1.相对定量实验所需材料1.相对定量实验所需材料 ?总RNA提取试剂 ?cDNA合成试剂盒 ?SYBRGreen Real-Time PCR Premix Kit（染料法）或 TaqMan Real-Time PCR Pr

2、emix Kit （探针法） ?用于相对定量实验的引物/探针(可选，用于TaqMan体系） ?应用于荧光定量PCR实验的8联排管或96/384孔板和应用于荧光定量PCR实验的8联排管 盖或光学封口模（根据厂家的仪器不同，相应配套耗材也不同） ?荧光定量PCR仪 ?离心机和离心管 ?DEPC water和PCR water ?移液枪、枪头、无菌手套 ?振荡混匀仪 2.相对定量的实验过程2.相对定量的实验过程 设计：设计：1. 相对定量实验的引物及探针设计、合成 2. 确定相对定量PCR实验应用的试剂 3. PCR循环设计 操作：操作：1. 相对定量实验样本的制备（RNA和DNA) 2. 试剂混合

3、 3. 仪器软件设置和运行 数据分析数据分析 相对定量的数学方法 Ct法基于相同条件下，目的基因的扩增效率与内参 基因的扩增效率相同的假设，所以引物设计就成为实验的关键 2.1.应用于相对定量实验的引物和探针设计2.1.应用于相对定量实验的引物和探针设计 如果使用TaqMan探针，那么TaqMan探针的结合位置应尽量靠近引物的结合位置， 最好仅相差一个碱基。TaqMan探针的分析方法依赖于Taq酶的5-3外切酶活性。 引物设计要点引物设计要点 ?引物长度和序列：引物长度一般为18-30base之间，在紧靠引物3端的5个碱基中不能出现2个或2 个以上的G或C序列，这样会增加非特异性扩增的可能性。

4、上下游引物避免出现连续的互补序列，防 止引物二聚体的形成 ?扩增产物长度：扩增产物长度最好控制在50-150bp之间，因为扩增较小的片断，PCR效率高。如果 扩增产品不能减少到150bp以内，但可以保证PCR效率接近100%的引物也可以使用。 ?G/C含量：G/C含量可以在30% 80%之间，不要出现连续4个相连的G. 如果引物序列中的G/C含量 过高会降低PCR效率，也可能会增加非特异性扩增的可能性。在使用SYBRGreen法的相对定量实验时 更应注意引物序列中的G/C含量 ?Tm值：引物的Tm值是关系到PCR循环设计的参数，引物的Tm一般设计在5860，上下游引物的Tm 不要相差2 以上。

5、探针的Tm值高于引物的Tm值5 10 左右 ?探针序列：在探针的5端结尾碱基不能是G，因为如果G存在，探针即使在水解后的荧光也依然会 被粹灭，影响结果分析 备注：如果您的设计经验不足，BIONEER可以提供TaqMan的设计合成服务备注：如果您的设计经验不足，BIONEER可以提供TaqMan的设计合成服务 2.2. 相对定量的样本制备2.2. 相对定量的样本制备 ? RNA制备：提取总RNA，用于相对定量的RNA的纯度要达到A260/A2801.8。对 于从特殊样本中提取的总RNA要保证提取后的RNA中不含PCR酶抑制剂。 ? cDNA合成：使用逆转录酶或逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA

6、，生成的cDNA可 以直接用于扩增. 合成的cDNA为避免反复冻融，合成后应立即分装以供多次 使用。 RNA制备和cDNA合成过程的注意事项：RNA制备和cDNA合成过程的注意事项： 1. RT实验用的器材（包括1ml、200l、20l Tip头；EP管和PCR反应管等）： 用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加1ml DEPC）37浸泡过夜，高压灭菌 。 2. 提取的RNA溶解和cDNA合成均要使用DEPC水 3. 合成cDNA时，RNA的用量和cDNA的产量与厂家提供的试剂盒有关，请参照试剂 生产厂家的说明书操作 2.3. 试剂选择2.3. 试剂选择 有两类预混合试剂盒可供选择：有

7、两类预混合试剂盒可供选择： ?SYBR Green Real-Time PCR PreMix:SYBR Green Real-Time PCR PreMix: 应用于基于SYBR Green方法的相对定量分析。要配合使用熔 解曲线软件分析，确定是否存在引物二聚体和非特异性扩增。如果引物设计合理，无引物二聚体和 非特异性扩增产生，那么使用SYBR Green是经济实用的最佳选择 ?TaqMan Real-Time PCR PreMix；TaqMan Real-Time PCR PreMix；应用于基于TaqMan技术的相对定量分析，结果无需使用熔解曲线 分析。如果无法解决引物二聚体和非特异性扩增

8、的问题，那么可以使用TaqMan探针来代替SYBR Gre en法，因为在TaqMan探针的定量PCR体系中，引物二聚体和非特异扩增不会产生荧光信号，所以即 使存在引物二聚体或非特异性扩增也不会影响结果分析 ?BIONEER相关产品：BIONEER相关产品：GreenStar Real-Time PCR Premix(SYBRGreen), Dual-Star Real-Time PCR Pr emix(TaqMan探针)，独特的冻干粉状Real-Time PCR Premix，有效避免分装时的加样误差。 -20条件下可达到12个月的保存期，远远超过液态Real-Time PCR Premix

9、 3个月的有效期。 自制荧光定量PCR试剂体系：自制荧光定量PCR试剂体系： ?常规PCR体系 ?SYBRGreen或TaqMan探针 备注：备注：Real-Time实验中通常使用热启动酶以降低引物二聚体和非特异性扩增出现的可能性， SYB RGreen对PCR反应有抑制作用，加入量要进行优化 混合试剂混合试剂 混合混合： 试剂按照体积大小从大往小的加，将引物/探针（TaqMan方法选用），Real-Time PCR Premix 和PCR water加入到反应管中，cDNA模板最后加。如果是同种引物/探针有多管 的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后

10、再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染 操作注意事项操作注意事项 1. 样本制备区和加样区要同扩增区分开，避免污染。定量PCR是非常灵敏的实验，微量污 染也会被扩增出，影响结果分析 2. 加样操作要做到非常精确，微量的加样误差也会对实验的重复性造成非常大的影响 3. PCR预混合液如果需要多次使用，要避光分装保存。避免反复冻融和荧光染料见光降解 4. 每次使用PCR预混合液时要等融化后完全混匀，否则对PCR效率造成很大影响 试剂50L体系20L体系终浓度 Forward Primer1-2l1-2l0.3M-1.0M Reverse Primer1-2l1-2l0.3M-1.0M

11、cDNA模板5-10l2-4l500ng DEPC water适量适量 总体积50L20L 备注：备注： 1. 大多数情况下，引物终浓度在0.5M是合适浓度。如果扩增效率不高，可提高引 物的浓度。如果发生非特异性扩增反应时，应降低引物浓度。引物种浓度请在 0.3M-1.0M进行优化 2. 初次实验时，最好将DNA模板进行梯度稀释，以内参基因的Ct值在15-25之间为 合适的浓度。 3. 定量PCR反应体系的配备与各试剂厂家提供的试剂而不同，使用其他厂家的试剂 时，请参照相关厂家的操作说明书配置 典型的PCR反应体系典型的PCR反应体系 ? 以BIONEER GreenStar qPCR Pre

12、Mix为例 步骤温度时间 预变性951-10min 循环中的变性9520s 退火50-6030s 延伸68-7230s 两步法PCR循环设计两步法PCR循环设计 步骤温度时间 预变性951-10min 循环中的变性9520s 退火/延伸6030s 备注：备注： 1. 变性时间长短由DNA来源和GC含量决定，退火的温度由引物的Tm值决定， 一般设为低于引物Tm值5 。延伸的时间由扩增产物的片断大小所决 定。PCR循环中各步条件都可以通过优化达到最佳。 2. 如果扩增产物片断长度在300bp以内。也可以采用二步法PCR进行实验， 即退火和延伸合为一步，温度可在60 -65 之间选择 2.4. PC

13、R循环设计2.4. PCR循环设计 三步法PCR循环设计三步法PCR循环设计 2.5. 反应板设计2.5. 反应板设计 设置样品孔时的关键要素（以BIONEER Exicyler 荧光定量PCR仪为例）：设置样品孔时的关键要素（以BIONEER Exicyler 荧光定量PCR仪为例）： ?探针（Probe) :探针（Probe) : 用来检测目的基因和内参基因的报告基团。 ?未知样品（Unknown Sample):未知样品（Unknown Sample): 要进行定量的未知目的基因样品和内参基因样品 ?阳性对照（Positive Control）阳性对照（Positive Control）

14、：无需设置专门的阳性对照，以内参基因代替 ?无模板对照（NTC)：无模板对照（NTC)：具备其他所有试剂，为加入DNA模板 ?样品名称（Sample Name): 样品名称（Sample Name): 定义样品的不同来源 设置样品孔时的注意事项：设置样品孔时的注意事项： ?要分别设置为不同的探针名称和不同探针颜色进行区分 ?设置无模板对照监控污染 ?同一样品至少做2个复孔以获得一致的重复性结果，相对应的内参基因样品也要做 同样数量的重复孔 ?在软件设置中，所有的样品孔设置“Unknown Sample” ,无模板对照设置为“NTC” 备注：备注：样品孔和对照孔的信息设置一定要正确设置，符合CT

15、分析方法的格式。 否则会导致实验结果不能用相对定量的软件进行自动分析 Sample NameProbe Name 应用举例：反应板设置样板应用举例：反应板设置样板 样品孔信息样品孔信息 3.数据分析数据分析 双击鼠标打开“Exicycler Analysis” 程序 在弹出的对话框中选择“Relative Quantification”,选择 “Ok” 扩增效率分析：通过观察荧光曲线是否是典型的“S”型曲线，可以判断扩增效率扩增效率分析：通过观察荧光曲线是否是典型的“S”型曲线，可以判断扩增效率 Flu.Graph中分析原始荧光曲线Flu.Graph中分析原始荧光曲线 ?大部分情况下，可以使用

16、自动生成的域值进行数据分析 在“probe”匡中选择 一种探针，然后将 “Threshod”和 “baseline”匡中的 “auto” 改 为”manual”, 调整基 线的起点和终点 基线起点：基线起点：进口试 剂起点设为3，国产 试剂起点设为6 基线终点：基线终点：如果最小的Ct值大于 18，那么终点设为15。如果大于 18，基线终点设为Ct3 如果数据质量不佳，如曲线形状不正常或重复性不佳，可以尝试进行基线调整，重 新生成域值进行数据分析 Flu.Graph在中调整基线Flu.Graph在中调整基线 在Report Form中分析数据质量在Report Form中分析数据质量 重复性分析重复性分析 重复样本Ct值差异0.5，数据为有效数据 如果Ct值差异0.5，删除变异大的数据重 新分析 选择参照：选择参照：选择 某种样本作为参 照样本进行分 析，被选择的样 本相对表达量为1 在R