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1、附件1：增强免疫力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目1.1 动物实验1.1.1 体重1.1.2脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值1.1.3细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5单核巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验1.1.6 NK细胞活性测定2 试验原则2.1 所列的指标均为必做项目2.2分为正常动物实验方案和免疫功能低下模型动物实验两
2、种方案, 可任选其一进行实验.2.3采用免疫功能低下动物模型实验方案时需做外周血白细胞总数测定3 结果判定3.1采用正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。 在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及NK细胞活性四个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫力作用。 其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，判定NK细胞活
3、性结果阳性。正常动物实验需进行四个方面的测定。3.2 采用免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及NK细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。 其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，
4、或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定NK细胞活性结果阳性。血液白细胞总数测定的二个以上剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总数结果阳性。免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测定。同时在各项实验中，任何一项测试都不出现加重免疫抑制剂作用的结果。32增强免疫力功能检验方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1. 原理：免疫系统主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴组织和全身各处的淋巴细胞、抗原呈递细胞等，还包括血液中的白细胞。淋巴细胞经血液和淋
5、巴使各处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体。胸腺属中央淋巴器官，主要功能是确保T淋巴细胞的产生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细胞；脾脏对抗原发生免疫应答作用，脾窦的巨噬细胞具有清除功能，脾白髓含有记忆B细胞，产生对T依赖抗原的体液免疫应答。淋巴细胞是特异性免疫应答的主要细胞群，按其表面标志物，分为T细胞、B细胞和天然杀伤细胞（NK）三大类，T细胞又分为CD4+（Th）细胞和CD8+T淋巴细胞。B淋巴细胞转化为浆细胞后能合成和释放抗原特异抗体，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗体功能。免疫系统可产生特异性免疫和非特异性免疫功能，检测上述免疫系统的各种代表
6、性指标的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判定。2. 实验动物选择推荐用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，68周龄，1822g（BALB/C种可16-18g），单一性别，雌雄均可，每组1015只。3. 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和1个阴性对照组。以人体推荐量的10倍为其中一个剂量，另设二个剂量组。必要时设阳性对照组。选做免疫低下模型法时，应设模型对照组。受试样品给予时间四周或30天。4免疫功能低下动物模型可选用环磷酰胺、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。4.1 造模原理：4.1.1环磷酰胺主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤淋巴细胞，
7、并可抑制淋巴细胞转化；环磷酰胺对B细胞的抑制比T细胞强，一般对体液免疫有很强的抑制作用，对NK细胞的抑制作用较弱。4.1.2氢化可的松主要通过与相应受体结合成复合物后进入细胞核，阻碍NF-B进入细胞核，抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放，达到免疫抑制目的。氢化可的松还可损伤浆细胞，抑制巨噬细胞对抗原的吞噬、处理、和呈递作用，所以氢化可的松对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用。4.2 免疫抑制剂剂量选择环磷酰胺可选择40mgkg，腹腔注射，连续两天，末次注射给药后第5天测定各项指标；氢化可的松可选择40mgkg，肌内注射，隔天一次，共5次，末次注射给药后次日测定各项指
8、标。各指标对两种模型敏感性不同，环磷酰胺模型比较适合抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、白细胞总数测定；氢化可的松模型比较适合迟发型变态反应、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK细胞活性测定，建议根据不同的免疫功能指标选择合适的模型。4.3 受试物给予连续给予受试物4周或30天，在第3周后开始给予免疫抑制剂，进行模型与预防性给药相结合的实验。5. 实验方法5.1血液白细胞数测定 小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数检测方法(仪器法)全血用EDTAK2抗凝后经血细胞分析仪检测，可测定白细胞数量，并可对白细胞进行分分类计数。5.1.1仪器和材料乙二胺四乙酸二钾（EDTAK22H2O，MW404
9、.47），离心管，全血细胞分析仪上样管，眼科镊子，振荡器，加样枪，冷冻离心机，全血细胞分析仪。5.1.2实验步骤5.1.2.1试剂配制血液抗凝：EDTAK2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，1.52.2mg的EDTAK2可阻止1ml血液凝固。抗凝剂配制：称量8mg EDTAK2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50l抗凝剂可抗凝1ml小鼠全血。5.1.2.2采血 以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。5
10、.1.2.3检测分析 上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数。上机操作参照仪器说明书。5.1.3数据分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，p0.05，结论：各组均数间差异无显著性意义；F值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的白细胞总数显著高于阴性对照组，可判定该项实验结果阳性。5.2 ConA
11、 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 可任选下列方法之一5.2.1 MTT法5.2.1.1 原理 当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。5.2.1.2 仪器和材料 RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4） 纱布、200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、大号注射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、
12、高压灭菌器、无菌滤器。5.2.1.3 实验步骤5.2.1.3.1 试剂配制完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10小牛血清， 1谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100ug/L）及5105mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20）保存。无菌Hanks液 用前以3.5的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。酸性异丙醇溶液 96mL
13、 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量（3-5ml）无菌Hanks液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3106个/mL。5.2.1.3.3 淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75l ConA 液（相当于7.5g/mL），另一孔作为对
14、照，置5CO2，37CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50l /孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超声震荡（2秒）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度计上在波长570nm测定OD值。5.2.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：
15、各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。5.2.1.5 注意事项ConA的浓度很重要，浓度过低不能刺激足够的细胞增殖，浓度过高会抑制细胞增殖，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳浓度。5.2.2 XTT法5.2.2.1原理由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，且溶解甲臜的有机溶剂有毒性，可选择XTT法替代MTT法。其原理是：XTT是二甲氧唑黄，在电子耦合试剂存在的情况下，活细胞线粒体中的脱氢酶可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲臜，生成的甲臜能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶联免疫检测仪检测定吸光值。5.2.2.2实验步骤脾细胞悬液制备同MTT法；淋巴细胞增殖反应：调整细胞浓度为5107，取细胞悬液100l分别加入96孔培养板中，一孔加510l ConA 液，另一孔作
