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1、7.8 染菌的防治,发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖,什么是染菌？,7.8.1 染菌的影响,造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失 扰乱生产秩序，破坏生产计划 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性 影响产品外观及内在质量,发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤,（一）染菌对发酵的影响,不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果,生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物,1、发酵染菌对不同品种的影响,放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多,不同
2、菌,不同产品,青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏,链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用,不同产品,疫苗生产染菌危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，
3、污染杂菌后的损失也越大,不同产品,2、污染不同种类和性质的微生物的影响,噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危害极大 污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产,（1）污染噬菌体,有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏 特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌,（2）污染其它杂菌,3、不同时间染菌对发酵的影响,杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时
4、间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长,污染时间是指用无菌检测方法确定的污染时间，不是杂菌进入培养液的时间,（1）种子培养期染菌,由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。 如果种子阶段染菌，应将培养液全部废弃,（2）发酵前期染菌,染菌防治措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救 如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用,发酵前期最易染菌，且危害最大,原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产
5、生很少，抵御杂菌能力弱。,（3）发酵中期染菌,杂菌大量产酸，培养液pH下降 糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶 产物分泌减少或停止，甚至会使已产生的产物分解 有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫,发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢,措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况 如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌,（4）发酵后期染菌,发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大,如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐,（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响,1、发
6、酵染菌对过滤的影响,染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难 即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想,如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤 由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡 染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率,污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异,2、发酵染菌对提炼的影响,采用离子交换树脂提取工艺的产品，如链霉素、庆大霉素，由于染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很
7、难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯,染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质,采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯,7.8.2 染菌的原因,总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法,（一）发酵染菌率计算基准,例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终,（二）染菌原因,造成染菌的因素很多，经验表明，对
8、绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象大多数是由于工作中“ 明知故犯”“ 不负责任” 和“ 侥幸心理” 所造成的,项目 百分率% 种子带菌或怀疑种子带菌 9.64 接种时罐压跌零 0.19 培养基灭菌不透 0.79 总空气系统有菌 19.96 泡沫冒顶 0.48 夹套穿孔 12.36 盘管穿孔 5.89 接种管穿孔 0.39 阀门渗漏 1.45 搅拌轴密封渗漏 2.09 罐盖漏 1.54 其它设备渗漏 10.13 操作原因 10.15 原因不明 24.94,日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析,上海第三制药厂染菌原因分析 项目
9、百分率% 种子带菌 14.15 盘管穿孔 14.20 阀门渗漏 23.30 空气系统有菌 10.0 管理不善 25.80 其它 7.49 原因不明 5.78,管理不善而染菌的有31个罐批，占25.80经分析有下表所列原因： 项目 百分率% 进罐前未做设备严密度检查 25.8 接种违反操作规程 25.8 检修质量缺乏验收制度 19.35 操作不熟练 19.35 配料违反工艺规程 6.45 调度不当 3.25,第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析 项目 百分率% 外界带入杂菌（取样、补料） 8.20 设备穿孔 7.60 空气系统有菌 26.00 停电罐压跌零 1.60 接种 11.00 蒸汽压力不足或
10、蒸汽量不足 0.60 管理问题 7.80 操作违反规程 1.60 种子带菌 0.60 原因不明 35.00,造成染菌的主要原因总结,1、设备渗漏,设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等 从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85 上海三厂的分析这类染菌为37.5 所以,加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的,2、空气带菌,从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96和 26% 国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度 因为空气除菌系统
11、较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败,3、种子带菌,种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌 加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的 种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成,4、灭菌不彻底,灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间产生过多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。 如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变化。,原材料储存和保管，如液胨、玉米
12、浆、母液糖等有机原料杂菌的数量 发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量有无灭菌的死角 对减少或避免染菌仍然是十分必要的,5、技术管理不善,技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理,7.8.3 无菌状况的检测,1、环境无菌的检查 尘埃粒子检测 无菌平板检测,2、种子及发酵液无菌状况检测,酚红肉汤培养基检测 平板划线 显微镜观察,7.8.4 染菌情况分析,染菌的原因有多种，对于实际情况如何分析呢？,1、单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效,2、多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题，特别
13、是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底,3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底,4、中后期染菌 补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题,7.8.5 染菌的防止,1、防止种子带菌,制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。 沙土制备时要多次间歇灭菌 注意接种时的无菌操作 子瓶、母瓶的移种和培养 无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。,无菌室要求,在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种 用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地，开启超净台的通
14、风， 接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。 接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净,2、防止设备渗漏,发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。 设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。 设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现
