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1、粗提取与鉴定,DNA,材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。,实验材料的选取,原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,鸡是真核生物，真核生物的DNA主要在染色体上。 鸟类的血细胞核大，DNA多 不需要破除细胞壁 问题：鸡血细胞液在取材之后，到实验前，是否需要特殊处理吗？ 柠檬酸钠抗凝,问题：鸡血细胞虽然没有细胞壁，但是依然有细胞膜，以你所学的知识，有什么比较简便但是可行的方法可以破碎细胞膜？,一、提取血细胞核物质（动物）,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,动物细胞利用细胞
2、的渗透压来破碎细胞。,植物材料，还可以通过加入一定量的蒸馏水来涨破细胞呢？,一、提取血细胞核物质（植物）,洗涤剂的作用： 洗涤剂也分为亲水基团和亲脂基团，可以与细胞膜中的蛋白质结合，使之溶解，进而瓦解细胞膜。 食盐的作用： 食盐中主要含有NaCl，有利于DNA的溶解。,问题：这时的滤液可能含有哪些细胞成分？ 主要有DNA、RNA、核蛋白、多糖等 我们应该如何将DNA单独分离出来？,DNA溶解在浓度较高的NaCl溶液溶液中,DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,根据DNA在NaCl
3、溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DN
4、A析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。,将物质的量浓度为2mol/L的氯化钠溶液加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。,二、溶解细胞核内的DNA,三、析出含DNA的粘稠物,缓慢贴壁加入蒸馏水，并用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.10.2mol/L，直到溶液中丝状物不再增加时为止。,四、滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤上一步中的溶液至1000mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上。,五、将DNA的黏稠物再溶解,取一个50mL的烧杯，向烧杯内注
5、入物质的量浓度为2mol/L的氯化钠溶液20mL，用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。,六、过滤含有DNA的氯化钠溶液,取一个100mL的烧杯，用放有两层纱布的漏斗，过滤上一步中的溶液，取其滤液，DNA溶于滤液中。,方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10-15minDNA滤液 嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶 蛋白酶能分解杂质蛋白，但对DNA没有影响，从而使提取的DNA与蛋白质分开 方案三：将滤液放在60-75的恒温水浴箱中保温10-15minDNA滤液。 大多数蛋白质不能忍受60-80 的高温，而DNA在80 以上才会变
6、性 利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。,DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,预冷的酒精，可以促进DNA的凝集,七、提取含杂质较少的DNA,纯化：向滤液中贴壁缓慢加入50mL冷却的体积分数为95%乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现含杂质较少的DNA丝状物。 用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。注意观察：丝状物是什么颜色的？,白色,DNA的鉴定,DNA遇二苯胺（沸水浴）会变蓝，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,八、DNA的鉴定
7、,溶解：在物质的量浓度为0.015mol/L的NaCl溶液5mL，放入丝状物，用玻璃棒搅拌，使之溶解。 显色：加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。,问题：如果溶液变蓝是否能说明DNA的存在? 设置对照组,除了可以使用二苯胺法，还有什么方法可以鉴定DNA？ 用甲基绿溶液直接滴在有DNA丝状物的载玻片或玻棒上，呈绿色反应,1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状
8、沉淀。 3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,小结,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,小结,小结,DNA遇二苯胺（沸水浴）会变蓝，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,实验操作小结： 制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心 破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方向快速 搅拌 过滤，除去细胞膜等。 溶解核内DNA 加入NaCl至2mol/L， 同一方向缓慢搅拌,DNA析出 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，再溶解到2mol/L溶液中 除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化 与等体积95冷却酒精混合，析出白色丝状物 除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色,
