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1、高效液相色谱法: 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上,采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压:150-350*105 Pa 高效:大于30000塔板/米 高灵敏:10-9g (紫外检测)、10-11g (荧光检测),第三章 高效液相色谱分析法 HPLC (High Pertormance Liquid Chromatography,) 2-1 高效液相色谱法的特点,一、HPLC与GC差别,1分析对象的区别 GC:适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品;但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型
2、及高聚物的样 品,尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC:适于溶解后能制成溶液的样品(包括 有机介质溶液),不受样品挥发性和 热稳定性的限制,对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛,占有机物的80%,2流动相差别的区别 GC:流动相为惰性,气体组分与流动相无亲合作用 力,只与固定相有相互作用。 HPLC:流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用 力,能提高柱的选择性、改善分离度,对分离起 正向作用。且流动相种类较多,选择余地广,改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用,当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离
3、选择性。 3操作条件差别 GC:加温操作 HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小),二、高效液相色谱仪流程图,三、HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效(n=104片/米),有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。(蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等) 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。,2-2 基本理论和条件选择,基础 理论,热力学理论:塔板理论平衡理论 动力学理论:速率
4、理论Vander方程,一、塔板理论,1.,二、速率理论(与GC对比),2)涡流扩散项及其影响,2.,讨论: 1)流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比),3)传质阻抗项及其影响,1,三、 影响分离的因素,1. 固定相与装柱方法的选择: 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 (dp10m) 首选化学键合相,匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相甲醇, 约1ml/min 3. 柱温的选择: 选室温250C左右,四、HPLC法中分离条件的选择,一、液固吸附色谱法(LSC) (liquid-solid adsorption chromatography) 二、液液分配色谱法
5、(LLC) (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法(IC) (ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法(SEC) ( steric exclusion chromatography,2-3 各类高效液相色谱法简介,1分离机制:利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异,分离前提:K不等或k不等,一、液固吸附色谱法(LSC) 流动相为液体,固定相为固体吸附剂,2固定相
6、:与LC比,固定相粒径不同(10m),(2)高分子多孔小球:YSG 原理:吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点:柱选择性好,峰形好,柱效低 适用:分离弱极性化合物,3流动相:底剂(烷烃)+ 有机极性调节剂 例: 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -,4影响k的因素:与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性,洗脱能力,k,tR 溶剂系统极性,洗脱能力,k, tR 注:调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间 5出柱顺序:强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱 6硅胶吸水量,LSCLLC 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量17% 分配色谱 硅胶失活载体 吸附的水固定液,1分离机制:利用组分在两相
7、中溶解度的差异 2固定相:载体+固定液(物理或机械涂渍法) 缺点:系统内部压力大,易流失,不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC 3正相色谱固定液极性 流动相极性(NLLC) 极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 流动相极性(RLLC) 极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分,二、液液分配色谱法(LLC),(一)常规化学键合相,利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面,1分离机制:分配 + 吸附(以LLC为基础) 2特点: 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱,4、化学键合固定相,(二)反相键合相固定相
8、,1分离机制:疏溶剂理论 正相流动相与溶质排斥力强, 作用时间 , k,组分tR 反相流动相与溶质排斥力弱, 作用时间, k,组分tR 2固定相:极性小的烷基键合相 C8柱,C18柱(ODS柱HPLC约80%问题) 3流动相:极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂(极性调节剂) 例:水 + 甲醇,乙腈,THF,4流动相极性与k的关系: 流动相极性,洗脱能力,k,组分tR 5出柱顺序:极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6适用:非极性中等极性组分(HPLC80%问题),(三)正相键合相色谱,1分离机制:溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力
9、2固定相:极性大的氰基或氨基键合相 3流动相:极性小(同LSC) 底剂 + 有机极性调节剂 例:正己烷 + 氯仿-甲醇,氯仿-乙醇,4流动相极性与k的关系: 流动相极性,洗脱能力,组分tR,k 5出柱顺序:结构相近组分,极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱 6适用: 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似(极性稍小) 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性 分析极性大物质、糖类等,1反相离子对色谱法(IPC或PIC),反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对,增加k和tR,以改善分离,1)离子对试剂:烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸 2)影响k
10、的因素 a与m的极性有关(同反相色谱) b与R的链长有关:R长,极性小,tR,k 3)适用:较强的有机酸、碱,三、离子色谱法(IC),2反相离子抑制色谱,在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相pH值,抑制 组分解离,增加其k和tR,以达到改善分离的目的,1)离子抑制剂:弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 2)k的影响因素:与流动相极性有关,还与pH值有关 选择流动相:应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR,k 碱性物质加入碱NH3H2O tR,k 调节pH范围:3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子 3)适用:极弱酸碱物质 pH=37弱酸;pH=
11、78弱碱;两性化合物,2对流动相的要求:,1)与固定液不反应 2)对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的 3)与检测器匹配: UV(常用,测定波长应大于溶剂的截止波长) 荧光,电化学 4)使用粘度小、纯度高的流动相(甲醇,乙腈) 使用前过滤、脱气,3洗脱方式,1)等度洗脱(恒组成溶剂洗脱) 以固定配比的溶剂系统洗脱组分(一个泵) 类似GC的等温度洗脱 2)梯度洗脱: 在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例 即不断改变其极性(两个泵) 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温(沸程较长样品),2-4 高效液相色谱仪,1泵: 恒压泵:流量精度不稳 恒流泵:常用 2进样装置 1)隔膜进样(高分子有机硅胶垫进样室) GC系统压力较小,可以 HPLC系统压力太大,必须停泵进样(早期) 2)阀进样:不必停泵,六通阀,液相色谱,3色谱柱:直径46mm,柱长1030cm 柱效评价:色谱系统适应性试验 R,n,fs(拖尾因子) 柱再生:维护、保养、柱子的冲洗 4检测器 1)紫外检测器:适于吸收紫外光的物质 2)荧光检测器:只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3)示差折光检测器:利用折光率的差别 灵敏度低,温度要求严格 4)电化学检测器 5)化学发光,