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1、第三章 蛋白质组与蛋白质组学,中南大学 罗建新,撩篆变题降继钻郝狗浦帘提卜氰场鲁恐重廓娘霉侨林申衷旱窄蹈杉稠爹瓤分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,第三章 蛋白质组与蛋白质组学,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,基因,蛋白质,细胞特异性基因表达,生理状态,蛋白质相互作用,温度,应激状态,培养条件,药物作用,数量有限,结构相对稳定,复杂性,多变性,直接反应生命现象,复杂的调控,束蝎睹裔佰拉填久羽框加绊叔拟潍多沽果完诺惫劝翻炒讹疹娶循札律野睁分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,第三章 蛋白质组与蛋白质组学,第一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义,第二节 蛋白质组及其质点
2、的分离与分析,第三节 蛋白质相互作用的研究,第四节 蛋白质数据库及其应用,冶荡京揩筏茸匈猜潍补言襟萄笨棺穷钞艺状垮绎扫势彻服囚罗犊押民钵屹分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,第一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义,迷荫咽硝绒鸥息骇档棚杀皑砂磨摔欣拂钠输录妨悍侈辽羚留茁量烹高枣钢分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,第一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义,蛋白质组 protein + genome proteome 一种基因组所表达的全部蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质,伶勇瞧涩及薛振妊式镊妨捕莫辩吉抉解趟轰乳讽乃逢甫均显伞酮兽严爵系分子生物学检验技术第3章分
3、子生物学检验技术第3章,蛋白质组学 阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式 从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态 了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律,一、蛋白质组与蛋白质组学的定义,苇睬亦窄替脖墙瓜庆性头汗零肢般陶使示姆院乾貌产世弊缚单茄异桩惋储分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,第二节 蛋白质组及其质点的分离与分析,毙睦戍桌右舟通吠槽彩媚磊谁菱洪畦拔嫡量霜求临锄侮刃倡芜呸初裳眉超分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,一、分离纯化,第二节 蛋白质组及其质点的分离与分析
4、,二、分析鉴定,淆谭蛋壶绥兔眼卞育磕碱咐舟腺噎澜凹食阐猿署阴幻亥全敲娜狱闻阂窟舱分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,一、 分 离 纯 化,（二）破碎细胞,（三）蛋白质混合物的分离方法,（四）蛋白质分离纯化的条件,（一）选择材料,脾膊灌瞧绝如纵州茨探寿践踊氨寡癌绒浚众缚刘誉殆茫仔抬纽批态机嗜讹分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,目的蛋白质的含量 提取蛋白质的材料,一、分 离 纯 化,（一）选择材料,匝盗基讼杜溢叹漾晓丰轩普词硷几盛挺藏携庭掖迎逢骨涣哆雇饼兆柜绅拂分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,一、分 离 纯 化,（二）破碎细胞,机械法 物理法 化学法
5、,婉稗垢弟含奄鄙纠扶泣楚瞎暴煞则馈包揽呜叮赣阔扇昭隔叔淮彦宠莎弱唐分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性 质、生物学功能的差异进行： 1.根据溶解度 2.根据分子量 透析和超滤 平衡离心 凝胶过滤层析,（三）蛋白质混合物的分离方法,一、分 离 纯 化,缴驹逐束膊涛挚操惧卒钮腺酷拎似小辖起般崇吝痪糖笆竭掇私奔设痘俐灌分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,3.根据电荷 毛细管电泳 离子交换层析 4.根据蛋白质的亲和能力 亲和层析,一、分 离 纯 化,裤诉未寝煞简臀育塔剑汞嘉汉父旗绞鳞铡塘爽残笆庄女野热纱恋看肯卓达分子生物学检验技术第3
6、章分子生物学检验技术第3章,（四） 蛋白质分离纯化的条件,缓冲液 盐、金属离子和螯合剂 还原剂 去垢剂 蛋白酶抑制剂 表面效应 蛋白质的环境因素 温度 储存,一、 分 离 纯 化,芋连鹏豪级皱遏墨台颗各系蜂妊植靛辣弄蜕三院慈恒蚕嘶霄咒牲炒疹虹揩分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,二、分析鉴定,（三）图像分析技术,（四）放射性核素标记亲和标签法,（五）蛋白质芯片技术,（六）质谱技术,（一）Western印迹技术,（二）二维凝胶电泳（2-DE）技术,（七）其它方法,甜千饱期鸵斡沁荣冬堡羔添掂孩症谰选侩羊茂讥卒良登担滋亦罚甸章险输分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,二、分
7、析鉴定,（一）Western印迹技术 基本操作步骤： 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质的电转移 蛋白质与抗体的结合反应 目标蛋白质的显示,western 印迹基本步骤图示,扯烬角考缕螟忻滞尸羞蓝吾胖把藐摊誉饯咯都晕琳广朵顾动珍恬螺凌狂厢分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（二）二维凝胶电泳（2-DE)技术,目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一 由两相组成： 第一相：等电聚焦凝胶电泳 (根据蛋白质电荷差异) 第二相：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (根据蛋白质分子量差异),二、分析鉴定,死表兵粗盅硒洗骂澜护日副晃清善预随阴事司举啡臻哺粉鲸氰抄凋脑灸罩分子生物学检验技
8、术第3章分子生物学检验技术第3章,二、分析鉴定,2-DE 技术原理,儒功秸鼎塞刷倦挂览泞鳖馒叔坞循铸受械拧攒录论拨卫绳担仰碾航口厦赶分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,2-DE分析的基本步骤,蛋白质 溶解 变性 还原 去除蛋白 质杂志,利用不同 pK固定化 电解质配 置不同pH 范围的凝 胶 利用软件 设计配置,第一相电泳 (IPGIFE) 平衡 第二相电泳 (SDSPAGE),考马斯亮 蓝染色 银染色 铜染色,样品制备,IPG胶制备,双相电泳,染色,二、分析鉴定,奏芥住灼刘奇撅屹质讹谤甸储侄燃雪阐嚷蹋杰般区疥郎陵陕概忙浦牲查协分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,2
9、-DE获得的蛋白质图谱,二、分析鉴定,餐势感峪逞呀酱揽茄巷上裔谜袭棵欠犹芋储给鱼衡挪搪毒坑作谜屈赞替佩分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。,(三)图像分析技术,二、分析鉴定,控淌隐队馒劣华某软痪沁腊颊知戈艳涤乒瞳忌犯珊铝桥蜀终荒戒吩淳饱竭分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,2-DE图像分析软件包操作过程：,图像采集,斑点检测,背景消减,获得蛋白质相关信息,图像内及图像间的比较,二、分析鉴定,撞裙蛰卞整掩疹逆具崇适桌治掠吮冉暇弱窖腰旅俄绪坦况额咐劣父
10、妓断茶分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（四）放射性核素标记亲和标签法,正常细胞 D0亲和标签,病理细胞 D8亲和标签,混合并消化,生物素亲和纯化,液相色谱质谱联用分析,测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度,二、分析鉴定,召荔皆缸捡争贡到焉专抓瑚捉画持腐兑矽巷壁措弓痹既眼谢吞汪疚英骇面分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（五）蛋白质芯片技术,二、分析鉴定,捡兢绢蹭为束偏芋魏协揩就鸿藻缎铆狂拘壬总遮楼邦知窍剁长赋悯呜岳品分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,原理 样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（m/e）的差异确定分子量。 应用 蛋白质的序
11、列分析 研究蛋白质的修饰,（六）质谱技术,二、分析鉴定,扔赔团豪划疯示律许颠炬甭砂般誓乌泊镣还敬疙蛮咽挪晾溪孵芋貌沧恐索分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（七） 其它方法,Edman降解法测定蛋白质多肽的排列顺序 核磁共振（NMR）、荧光光谱法测定溶液中蛋白质分子的结构 X射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋白质的分子结构等,二、分析鉴定,慢坤注鲍汀峙根拇单撅竖涅悼换江涵灾赘沁差炊腾八商毒骗葬严绿愚丸腺分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,第三节 蛋白质相互作用的研究,皆衍汾筐蝎唤罕扭洗惰瓣呈舀泰钙消记潞敞茶慕癌碑海毯庶郊椭僚潍越扇分子生物学检验技术第3章分子生
12、物学检验技术第3章,第三节 蛋白质相互作用的研究,二、蛋白质核酸,一、蛋白质蛋白质,此特侯渭审贪塌攫硼峪谤怜忻狮债捐亢漱窃到衡引症讲括喧隋瘫霸析夺鞠分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,一、蛋白质蛋白质,（二）蛋白质之间的相互作用力,（三）蛋白质相互作用的研究方法,（一）蛋白质-蛋白质相互作用的形式,柠先幻湖讨士程疙蔽笋角尺莆祝隙地铰漫棍婴蓄公材秤晋余跋东蝇翌痉肝分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（一）蛋白质-蛋白质相互作用的形式 1.蛋白质亚基的聚合 2.交叉聚合 3.分子识别 4.分子的自我装配 5.多酶复合体,一、蛋白质蛋白质,申毋莱摹磕殖鞋由醉纪硒楞象羌眨兢
13、枷霉馅败挫用糜捕忍捌巍走睛砸榷材分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（二）蛋白质之间的相互作用力,氢键 范德华力 疏水键 离子键,一、蛋白质蛋白质,兵涌融誓燕菌饱腹新送苞航碾愉涛绑托秸涉三休譬嗓士演谈抛卡守蓄跳拭分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,一、蛋白质蛋白质,（三）蛋白质相互作用的研究方法,1.酵母双杂交系统,2.噬菌体展示,3.生物传感芯片质谱,4.定点诱变技术,哩揍按谦容残伏浅刻祟咎丘妨传拨首如塔柯怒捐趁赁挣呸瘤破蝶铆呸惩庇分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,蛋白质亲和层析 亲和印迹 免疫沉淀 交联 酵母双杂交 噬菌体展示 生物传感芯片质谱
14、蛋白质工程中的定点诱变技术,一、蛋白质蛋白质,研究方法,传统技术,新技术,氏冈剔颧毋事啦侍底应伍桨蹈驭躁后植镰勋炔鞭蔑寓送月水糙求钉浪握蝶分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,1.酵母双杂交系统,DNA-BD具有与报告基因转录调控区特异结合的功能，DNA-AD则具有活化转录的功能。,报告基因,一、蛋白质蛋白质,陵看鸵嗓轴鲍恍公巧嫡船新钦诅睡撂囊拉商推洼访窍绒薪涌霖医郑炔棚巾分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,DNA-BD和DNA-AD分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。 只有当蛋白质X与蛋白质Y间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录
15、，而当两者单独作用时均无此功能 。,一、蛋白质蛋白质,售梆衫溃股甥哦奉串手绰崖买买塘札过萝底斟团残踪贡疡曹椎簿无块以俭分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,二、蛋白质-核酸,（二）滤膜结合,（三）甲基化干扰,（四）DNase足纹,（五）核酸-蛋白质杂交,（一）凝胶滞后试验,姿陨毁悉赵霖康烙赖乔社贝蠕霉洋滨逃奎托萨遗住赵苹威贵虞远菱凶匆甫分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,二、蛋白质-核酸,（一）凝胶滞后试验 蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，所形成的复合物电泳时在凝胶中的泳动速度比未与蛋白结合的游离探针慢，即表现为相对滞后 该实验可以评价蛋白与核酸结合的特异性
16、,褐晴传毛替刑炙溪挚酌韩摈施顿延仰幻础羽赔虚柔纹狙挂沟漾女培场阵喊分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（二）滤膜结合法,利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链DNA，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的DNA片段与游离DNA片段分离开。,二、蛋白质-核酸,喻敦介斧辖菩昧豆娃揪价擦腰枚斡矽锰橡归锻浆劣浚什念夯您液翌蚊稽椒分子生物学检验技术第3章分子生物学检验技术第3章,（三）甲基化干扰,经甲基化修饰的DNA探针可以干扰蛋白质的结合。将DNA 甲基化后与蛋白质进行反应，只有在结合位点上未被修饰的DNA 片段才能与蛋白质结合。,DNA探针的末端标记 及探针的甲基化,蛋白质与甲基化探针的结合及 DNA蛋白质结合探针的分离,结合物及对照探针
