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1、第一章 RNA的提取和cDNA的合成,RT-PCR原理及应用,应用：基因检测、基因转录产物的分析、 合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统,一、RNA的提取,RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。,采取的措施： 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小时以上。 3、不能用高温烘烤的材料如塑料容器、试剂等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的DEPC 。,注意事项： 1、DEPC与氨水溶
2、液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。,总RNA提取方法（试剂盒）： 异硫氰酸胍苯酚法（Trizol 法） 原理：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNA，就可以得到纯净的RNA。,二、cDNA的合
3、成,反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 种类：两种 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 包括两个多肽亚基（最适温度42） 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。,2、鼠白血病病毒(MLV)反转录酶 只有单个多肽亚基（最适温度37） 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。,cDNA引物 种类： 1、随机六聚体引物：不特异的引物 体系中所有RNA分子全部充
4、当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。,2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。 由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。,3、特异性引物 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,第二章 聚合酶链式反应（PCR）,一、PCR基本步骤,三个步骤：
5、 1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94下解链。 2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。 3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度(72左右)下，以目的DNA为模板进行合成。,二、PCR反应中的主要成分,引物：好坏是PCR成败的关键。 设计原则： 1、引物长度约为16-30bp 2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm4(G+C)+2(A+T)，且接近72最好。 3、四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。,
6、4、引物3-端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3-端应不存在二级结构，且3-端尽量不用T，尤应避免连续2个或2个以上T，因为T引发错配的几率高。,6、两引物之间尤其在3-端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5-端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。,8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。 引物浓度： 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1
7、.0mol/L。 引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低 则降低产量。,4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)： dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。 4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。,Mg2+： Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。 通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PC
8、R反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。,在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。 模板： PCR中模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。,就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。 一般反应中模板量为102-105个拷贝。扩增单拷贝基因，需要0.1g的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。多拷贝基因扩增用量更少。 模板过多可能增加非
9、特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。,Taq DNA聚合酶： 一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min，95 40min， 97 5min。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74 30min，掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为210-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。,所用的酶量适当。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。 反应结束后，需要灭活Taq DNA聚合酶。 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR产物经酚/氯仿抽提，乙
10、醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。,反应缓冲液： 反应缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长DNA片段有利。 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。,三、PCR反应参数,变性 在第一轮循环前，在94下变性5-10m
11、in非常重要，它可使模板DNA完全解链。 变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。 一般变性温度与时间为94 1min。,在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。 对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,退火 引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。 一般当引物中G、C含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。,实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值
12、约低5。 通常退火温度和时间为37-55，1-2min。 退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。,延伸 延伸反应通常为72，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75。 实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20-85。 延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。 在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。,延伸时间过长会导致产物非特异性增加。 但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。 一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整
13、的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,循环参数 一般而言，25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。 通常经25-30轮循环后，反应中Taq酶已经不足。 如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109-1010。,在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。 平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。 因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应
14、，减少非特异性产物。,四、PCR产物的纯化,酚/氯仿法 Kit法,五、PCR产物的克隆,利用T-Vector克隆 Taq DNA聚合酶会在3-端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。 利用这一特点，可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT，使载体与PCR产物末端互补并进行连接。,粘性末端连接 利用引物中附加在5端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA。 如果上、下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点，经酶切后定向克隆到载体中。,第三章 DNA酶切及凝胶电泳,一、DNA的限制性内切酶分析,
15、类限制性内切酶 识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。 类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段。 如，Sma：5-CCCGGG-3,有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。 如，EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5,酶切反应 单酶切：各种酶缓冲液、反应温度不同 如，BamH反应温度为30 双酶切：缓冲液不同，反应温度为37。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
16、酶切时保护碱基的个数,二、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。 琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度200bp至50kb的DNA片段。 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。,在电场中，带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由多种因素决定： DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。,琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。,DNA分子的构象 相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。 电源电压 在低电压时，线状DNA片段的迁移速率
