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1、,绪 论 重庆医科大学病理教研室 王娅兰 教授(博士生导师),分子病理学(molecular pathology)基本概念 现代分子生物学 vs 传统病理学 疾病发生过程中 分子事件及其与疾病发生的关系 揭示 根本机制 个性化治疗依据,本课程基本内容 针对基本病理过程 分子事件 本课程组人员构成,分子肿瘤概论,一、有关肿瘤的基本概念（复习） 肿瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 调控失常 异常增生 新生物 肿瘤生物学行为-浸润、转移能力 浸润 (invasion)：起源处迁移 侵入周围邻近组织,转移(metastasis)： 从原发部位 血管、淋巴管、体腔 它处继续生长 与原发瘤同
2、样类型肿瘤 （转移瘤或继发瘤）,转移的途径,浸润生长是恶性肿瘤生长的特点， 也是肿瘤转移过程必经的第一步。,肿瘤的组织结构 实质 （parenchyma) 间质 （mesenchyma, stroma) 肿瘤间质的主要成分 1 血管 毛细血管，小动、静脉 血窦样血管 血管球样增生 血管内皮增生肿胀，绒癌、浅表皮肤黑色素瘤则无血管，通过弥散获氧,2 结缔组织间质 （1）纤维和基质 胶原纤维 常规 HE - 红 特殊化学染色 VG 改良法- 红 Masson- 兰色 构成成分 I II III型胶原原纤维 又由相应原纤维分子构成 免疫组化或分子生物学方法可区别,弹力纤维 常规 HE-淡红色 特殊化
3、学染色 Weigert或Verhceff-暗兰或黑色，弹力 酶消化后阴性,网状纤维 银染-黑色，故也称嗜银纤维。 PAS -强阳性 成分 胶原蛋白为主要成分 细胞间质网状纤维- 型胶原蛋白 基底膜网状纤维- 型胶原蛋白和 层黏连蛋白（laminin）,纤维黏连蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 连接基质中各种成分 B. 介导细胞外基质成分与细胞表面连接 黏蛋白 又称蛋白多糖（proteoglycan） 如透明质酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin）,（2）基底膜 (basement membrane , BM) 多种成分 与肿瘤浸润关系密切 型胶原 -不形成纤维，与、
4、 型胶原不同 层黏连蛋白 （laminin ,LM） -有与细胞膜LM 受体相结合的位点,（3）细胞成分 固有的细胞成分 -纤维母细胞和纤维细胞 -肌纤维母细胞 -间充质细胞 -巨噬细胞 -树突状细胞,反应性细胞成分 各种细胞浸润 - 淋巴细胞 最常见 -浆细胞 -巨噬细胞 都属免疫活性细胞,二、肿瘤浸润、转移的分子机制 （一）肿瘤细胞的浸润转移 1.肿瘤细胞增殖和扩展 浸润转移的前提和基础 2.肿瘤血管生成(tumor angiogenesis) 肿瘤浸润转移的必要条件,3.肿瘤细胞分离脱落，与细胞外基质黏附 （1）瘤细胞表面负电荷增加 （2）瘤细胞黏附力的改变 瘤细胞自身结构异常 瘤细胞同
5、质黏附力下降 指同种瘤细胞之间的黏附力,瘤细胞异质黏附力增加 指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力 同质黏附力降低，有利于肿瘤细胞分离； 异质黏附力的增加，有利于瘤细胞与基底膜、间质成分粘附并穿过这些组织 均由黏附因子介导 通过配-受体之间的识别和结合实现,（3）肿瘤黏附因子(adhesion molecules) 细胞表面结构 钙黏蛋白(cadherin) 又称为钙连接素，钙黏素。 依赖细胞外钙 介导钙离子依赖性细胞与细胞（同源细胞）的黏附 据分布不同 E-钙黏蛋白 P-钙黏蛋白 N-钙黏蛋白 H-cad,整合素(integrin) -细胞表面糖蛋白 ，约有20 多个亚型 -各种肿瘤细胞表
6、面整合素种类不同 -肿瘤生长各个阶段表达水平也不同, 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主要参与细胞与细胞间的连接 ICAM-1 （细胞间黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神经细胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC,选择素(selectin) 内源性植物凝血素（凝集素） 作用 介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附 选择素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin, CD44 及其它 CD 44(透明质酸受体) 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ）,4.瘤细胞的迁移(migration
7、)及化学趋向性 (1)瘤细胞的运动 黏附；肌动蛋白、微管、中间丝 (2)瘤细胞运动的调节,据其作用，大致可分为两大类： 仅影响运动的因子 迁移刺激因子（MSF） 既影响运动又影响生长的因子 AMF (自分泌运动因子) HGF/SF（肝细胞生长因子/分散因子),(3)瘤细胞的化学趋向性 21KD 的蛋白质 骨吸收因子,5.细胞外基质的降解 (1)肿瘤浸润细胞外基质的步骤 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他间质成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤细胞 邻近的细胞外基质 第三步 进入受蛋白酶降解的基质区域内,(2)肿瘤细胞产生的蛋白水解酶 丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子 纤溶酶
8、 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP） 需钙、锌离子作辅助因子 MMP 分类 胶原酶：如间质胶原酶 （Collagenase） 明胶酶：如明胶酶A (gelatinase A) 间质溶素：如间质溶素1 、2 膜型基质金属蛋白酶：、型,胱氨酸蛋白酶类 Cathepsin B 天（门）冬氨酸蛋白酶 cathepsin D, E,6.瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子 微小淋巴管、微小静脉壁 缝隙 血管 基底膜缺损 瘤细胞存在形式 单个 成团 同类癌栓 异类癌栓 黏附分子对其发挥调节作用,7.在特定器官的毛细血管滞留并黏着，再次穿过血管壁并定居、增殖 器官
9、特异性（选择性）机制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化学趋化因子（归巢现象) (3) 微环境不适合 (4) 与免疫状态有关,（二）机体免疫状态与肿瘤浸润转移 参与控制转移的免疫细胞主要有 NK 细胞 巨噬细胞 T 淋巴细胞 （三）肿瘤浸润转移相关基因 转移相关基因 指基因的表达和改变能够促进或导致肿瘤发生转移的基因,（四）肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移 表观遗传学(Epigenetics) -与遗传学(genetic)相对应的概念 -表型状态改变，基因型不改变 -没有DNA序列变化的情况下， 可遗传的基因表达改变，导致的基因产物的变化。 -1942年提出，上世纪80年代后期逐渐兴起的一门新学
10、科,DNA的“后天性”修饰 CpG岛高甲基化 癌细胞基因组低甲基化 组蛋白残基的各种修饰 磷酸化 乙酰化 甲基化,（五）肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC) 2001年由Reya等提出 2006年美国癌症研究协会（AACR）定义 存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞,特征 (1) 无限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信号传导途径 (3)具不同表型，异质性，对放化疗不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能转移到各种不同的组织,（六）肿瘤微环境与肿瘤浸润转移 肿瘤细胞 间质细胞 细胞外基质 间质细胞所分泌的活性介质（细胞因子） 共同构成的局部
11、内环境,微环境改变 肿瘤细胞 -自分泌和旁分泌 全身和局部组织 -代谢、分泌、免疫 结果： 限制或促进肿瘤的发生和发展,三.肿瘤学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用 (一)蛋白表达异常的检测 -免疫组化（荧光）定位 -ELISA和Western blot 定量,抗原,抗体,标记,标记,抗原,标记,标记,抗原,标记,（二）基因拷贝数、转录产物mRNA异常 - 核酸分子生物学方法进行检测 核酸变性、复性基本性质 常用方法,1. 核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridisation）技术 最常用的基本技术 基本原理： -标记的已知碱基序列 （DNA或RNA单链片
12、段） （探针probe ） （同位素 P32 I125 非同位素 生物素 地高辛 荧光素） -检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之 同源的序列,（1）原位杂交 （ISH） （2）荧光原位杂交 （FISH）， （3）双色（多色）银染原位杂交（DSISH） （4）Southern blot (DNA 杂交) （5）Northern blot (RNA 杂交),2. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction , PCR）技术 又称体外基因扩增 利用DNA变性和复性原理 体外进行 特定的DNA 片段高效扩增 获得或放大特异基因信号的重要手段,扩增产物的检测 凝胶电泳分析 琼脂糖
13、凝胶电泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 单一条带,Real-time PCR 原位PCR RT-PCR 3.基因芯片技术,(三)基因突变的检测方法 1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP） 长度相同，但碱基序列不同的单链DNA 构象不同 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳 迁移率（泳动率）不同,基本方法 作PCR 将产物变性而成为单链 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 显示结果 可用同位素/荧光素标记 非同位素
14、标记,2.PCR-限制性片段长度多态性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技术 基本原理 -序列中一个碱基发生改变 -使原来的内切酶位点消失 或产生新的酶切位点 -用限制性内切酶消化PCR 扩增出来的DNA片段 -检测其酶切片段长度的差异,3.变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 基本原理 电泳时，不同浓度凝胶温度不同 DNA链中有一个碱基改变 在不同的温度发生解链 电泳迁移率改变,4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 荧光原
15、位杂交 ( FISH) 6 DNA 芯片技术（DNA chip ）,（四）肿瘤的微卫星不稳定性分析 微卫星不稳定性（microsatellite instability , MI）, 是指简单重复序列的增加或丢失 检测方法 PCR + DNA 序列凝胶电泳,（五）肿瘤易感性检测 采用相应基因变异方法进行检测 （六）肿瘤相关病毒 核酸杂交技术与PCR技术 (七) 基因重组技术 主要目的是获得某一基因或DNA片段的大 量拷贝 (八) 基因转染（gene transfection）技术 （九）RNA干涉(RNA interference）,核酸杂交/PCR技术与免疫组化/荧光、WB方法结合 免疫组化/荧光 在翻译水平上定位研究基因表达 核酸杂交/PCR技术 检测DNA/RNA， 在基因或转录水平研究基因表达,（十） 激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection，LCM) -显微镜直视下 -组织切片 -确定、分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞,（十一）共聚焦激光扫描显微镜技术(Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM) 细胞“CT” ，上世纪80年代 -组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态改变,应用 能观察各种荧光标记
