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1、掌握免疫组化技术的概念、原理、优点、ABC染色的基本操作，了解免疫组化染色技术的其他几种方法及临床应用。,学习重点,主要讲述的内容,概述 免疫组化的概念和优点。 免疫组化染色前的准备。 抗体的标记 如何降低非特异性染色。 免疫组织化学方法 免疫组化结果的判定以及染好切片的关键 免疫组织化学的应用。 免疫酶组织化学染色图片举例。,免疫组织化学又称免疫细胞化学，其主要原理是用 荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细 胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定 量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧 光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的 物质，如蛋白质、多肽、核
2、酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可应用相应的特异性抗体，将其用免疫细胞化学手段检出，并研究。,概念,1. 高度的特异性 抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细 胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体， 具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基 酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。,免疫细胞化学的突出优点是：,2. 敏感性高 现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度 保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增 敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证 可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子 显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或 基因水平的检测
3、技术。,3. 方法步骤统一 若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。 4. 形态、机能和代谢密切结合 是一种集定性、定位和定量密切结合；形态、 机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。,抗原修复,常规石蜡切片的标本一般均采用甲醛固定，甲醛固定的部分组织细胞免疫组化的敏感性明显降低，主要原因为甲醛固定过程中形成的醛键以及甲醛固定导致的蛋白与蛋白之间的交联，均会封闭部分抗原决定簇，同时甲醛的这种交联作用会影响细胞膜的通透性，使抗体分子难于渗入细胞内，从而影响染色效果。,化学方法(酶消化方法) 胰蛋白酶(trypsin)消化方法 酶浓度一般为0.05%0.1%, 胃蛋白酶(pepsin消化方法 0
4、.4%胃蛋白酶 链霉蛋白酶(poruse)消化方法 浓度为0.1%。,物理方法 单纯加热方法; 高压加热方法; 微波方法,微波方法,将切片常规脱腊后水洗，放入盛有枸橼酸缓冲液的容器中，置微波炉加热沸腾，时间为5min2次。 加热完毕，将切片缸在室温下放置，使缸内温度自然下降至40左右，蒸馏水洗，进入免疫组化染色。,抗体的标记,为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记，利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大，并转换成可见的荧光或呈现出颜色。,免疫组化染色中比较成熟的标记物有：异硫氰酸荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白、胶体金、葡萄球菌A蛋白、生物素、放射形核素等。 由于标记物和抗体结合，酶促反应的定位
5、就间接地显示抗原-抗体反应的定位。,免疫组织化学染色中的非特异性着色,凡不属于特异性抗原抗体反应所呈现的染色。 原因： 组织方面：自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等。 试剂方面：抗体不纯、标记酶或荧光不纯或标记过量等。,在滴加一抗前，采用非免疫动物血清封闭组织中的带电集团，避免与第一抗体的非特异性结合。 阻断内源性酶。如3%的H2O2等。 增加第一抗体的稀释度 调整孵育时间及反应温度 避免染色过程中标本干枯等方法。,免疫酶组织化学消除非特异性染色的几种方法,免疫组化染色方法,(1)免疫荧光法 (2)免疫酶标法 (3)免疫胶体金法,免疫荧光法的基本原理,将已知的抗体分子标记上
6、荧光素，再与相应的抗原起反应，形成的抗原抗体复合物因带有荧光素，在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的免疫复合物结合部位，从而做出判断。 作为病理诊断，免疫荧光法具一些不足之处,如： (1)特异性抗体用量大； (2)敏感性及特异性不够理想； (3)荧光强度随时间延长而慢慢减弱； (4)需要昂贵的特殊显微镜。,免疫酶组织化学方法,60年代日本学者Nakane等首创建立了酶标记抗体技术检测组织中的抗原，免疫酶组织化学技术的特点： 可用普通显微镜代替荧光显微镜； 切片不易褪色，可长期保存； 阳性细胞定位精确； 组织结构清晰； 可作免疫电镜超微结构观察等优点。,标记抗体法 不标记抗体法,常用的免疫酶组织化
7、学方法,免疫酶组织化学常用的酶,理想的标记酶的要求 酶的活性高且稳定 终产物稳定，不扩散，有良好的定位 酶和抗体的结合不影响抗原和抗体的结合 在组织中和体液中不存在内源性的酶及其底物,应用最多的标记酶,辣根过氧化物酶（HRP） 稳定性好，在PH3.512范围, 60加热15分钟不失活 穿透性强，溶解度大. 底物为H2O2，DAB（3，3-二氨基联苯胺）为供氢体,反应式为： HRP. H2O2 +DH2 HRP+D+2H2O 碱性磷酸酶（AP）,ABC三步法(亲和素-生物素-过氧化物酶连结法),ABC法是利用亲和素（卵白素）与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质,先将生物素与辣根过氧化酶（HRP
8、）结合，形成生物素化HRP(B液)，然后与亲和素(A液)按一定的比例混合，形成ABC复合物。用生物素化的二抗与一抗结合，再与ABC复合物结合，最后用底物显色剂显色。,ABC 复合物,A液亲和素液,B液与生物素结合的过氧化物酶溶液,ABC 法,优点：,敏感性高，约为PAP法的8-40倍； 特异性强，非特异性背景着色低； 方法简便，应用范围广。,步骤：,石蜡切片脱蜡至水； 缓冲液洗； 3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶; 缓冲液洗； 滴加非免疫动物血清20min,步骤,步骤,直接滴加第一抗体； PBS冲洗； 滴加生物素化的二抗； PBS冲洗； 滴加ABC复合物； PBS冲洗； DAB显色。, S
9、P法或LSAB、SABC法(链亲和素-过氧化物酶连结法),用链亲和素（SA）代替ABC复合物中的卵白素蛋白（亲和素）即形成SP法。染色原理同ABC法。 LSAB法中由于采用链亲和素，避免了与组织中内源性生物素结合的可能，所以背景染色低、放大效果高。其标记技术比PAP、ABC法更为简便、敏感、特异，且价格较低而在我国逐渐普及。,IGS法(免疫金法)： 用金标记代替酶标记。,IGS的基本原理是先用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体或A蛋白再与特异性抗体结合，再用乳酸银处理，银颗粒沉积在金颗粒上，还原银显示为黑褐色。,免疫组化结果的判断原则,每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础,才
10、能对染色结果做判断。 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。 阴性结果不能视为抗原不表达,即阴性结果无判断意义;阳性结果有强弱、多少之分, 当免疫组化结果与HE切片诊断有矛盾时,以HE切片诊断为准。 应用“反证法, 确保免疫组化在诊断病理中的准确性。 避免假阴性和假阳性的发生。,免疫组织化学的应用,(一)提高病理诊断的准确性,病理诊断当属坚信不疑的，但在实际工作中要做到100%是不可能的。采用免疫组化检查后，部分疑难病例最后获得正确诊断。应用免疫组化方法，可以大大提高病理诊断的准确率，有利于疾病的临床诊治。,1、激素受体及生长因子的检测在预后及治疗方面的应用,激素受体和各种生长因
11、子对正常组织的功能调节是必不可少的，同时也可影响着肿瘤的生物学行为。应用免疫组化方法，可对肿瘤内各种激素受体与生长因子进行定位、定量分析，这已广泛应用于肿瘤临床工作。,(二)在肿瘤病理学的研究和诊断中的应用,如对乳腺癌与激素受体关系的研究已有了较明确的结论，即雌激素受体阳性的乳腺癌患者预后优于阴性者，而且阳性者对内分泌治疗反应好、无瘤生存期延长。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。,2、癌基因蛋白表达的临床及预后方面的研究应用,对癌基因(oncogenes)在肿瘤生物学中的价值已有大量的研究，用免疫组化的方法可对这些癌基因蛋白进行定位和定量的检测，以探讨其临床意义。虽然癌基因的种类繁多，但目前
12、已有肿瘤临床意义的却十分有限，主要是c-erbB-2、c-myc、ras和p53。,在乳腺癌的研究中发现表达cerbB-2的浸润性乳腺癌患者预后差。恶性度高者阳性率高。在卵巢癌中阳性率为30%，而且提示，阳性表达的卵巢癌者预后要差。,c-myc是作用于核内DNA的癌基因，可剌激DNA的合成。c-myc的过度表达则促进肿瘤的生长和发展，因而肿瘤的侵袭性增加。在对宫颈癌、小细胞肺癌的研究中已证实，c-myc表达增加者存活期缩短。,p21是一种ras癌基因蛋白，己发现在肝细胞癌、大肠癌中表达增高，在卵巢癌亦有过度表达的报道。对于其预后意义则仍有一些不同的看法。,3、对肿瘤细胞增生程度的评价,肿瘤细胞
13、增生是否活跃直接影响着临床治疗与预后。判断一个肿瘤是否生长活跃方法较多，有核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)的染色、3H-胸腺嘧啶摄入放射自显影、流式细胞术(FCM)等，但实践证明其中以免疫组化法对瘤细胞增生抗原进行定位定量最为简便、可靠，主要是通过Ki-67和PCNA(prolifer-ation cell nuclear antigen)的单克隆抗体来实现的。,4、发现微小转移灶,用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法则十分有助于微小转移灶的发现。,5、在肿瘤分期上的意义,在判断肿瘤是原位还是有浸润发生以及有无血管、淋巴管的侵袭是与肿
14、瘤分期密切相关的。采用免疫组化法检查可获得明确的结果。如采用层粘连蛋白(laminin）和型胶原的单克隆抗体可以清楚地显示基底膜的主要成分。一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润性癌了，其预后意义是不同的。,6、指导肿瘤的治疗,应用免疫组化的检查结果发现，在肿瘤的治疗上也有应用前景。如许多肿瘤对化疗不敏感，是由于瘤细胞内多药耐药基因(multidrug resistant gene)编码的酶的活性增加所致。如二氢叶酸还原酶以及P-糖蛋白增加，用免疫组化方法可以检查细胞内的这些酶或糖蛋白，以了解肿瘤是否有抗药性。,7、在肿瘤病理学的研究和诊断中的其他应用,组织起源不明肿瘤的判断。 研究病原体与肿瘤的关系 协助确定肿瘤的良恶性 分化差的癌和肉瘤的鉴别：CK、Vimentin、LCA、S-100等。 确定原发病灶 PSA阳性-前列腺癌转移 甲状腺球蛋白阳性-甲状腺癌转移,(四)病原微生物的检查,(三)免疫性疾病的辅助诊断,步骤：,石蜡切片脱蜡至水； 缓冲液洗； 3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶; 蒸馏水洗2次； 微波抗原修复； 缓冲液洗； 滴加非免疫动物血清20min,VEGF免疫组化实验操作步骤,步骤,直接滴加第一抗体； PBS冲洗3次； 滴加生物素化的二抗； PBS冲洗3次； 滴加ABC复合物； PBS冲洗3次； DAB显色。,
