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1、宁波市疾控中心 微生物检验所 杨 元 斌 May 6th, 2014,霍乱弧菌的检测,学习要点：,霍乱弧菌概述与分类 霍乱弧菌的标本采集 霍乱弧菌的分离培养 霍乱弧菌的鉴定,霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大流行。 典型临床表现：剧烈的呕吐、腹泻（无痛性） 、米泔水样便、脱水，死亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病。,一、概述,大便小便,病原学,形态：霍乱弧菌属于弧菌科弧菌属，革兰染色阴性菌体短小，稍弯曲，两端钝圆，长1.52.0m,宽0.30.4m 。 菌体尾端有单鞭毛，运动极为活泼，在暗视野显微镜下呈流星样
2、运动，培养温度以37为最适宜，在碱性（PH8.89.0）肉汤（或蛋白胨）培养基上易于生长（耐碱怕酸）,革兰染色,鞭毛染色,霍乱弧菌涂片、染色,根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌分成200个血清群。 根据是否与O1抗血清凝集分两大群， O1群霍乱弧菌：凡能与O1群抗血清发生凝集 非O1群霍乱弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。,分群与分型,1、古典生物型（前6次大流行） 2、E1 Tor 生物型（第7次 1961年来）。 两个生物型具有相同的血清型。我国流行以El Tor霍乱弧菌为主。,O1群霍乱弧菌的生物型,古典生物型与El-Tor生物型区别,O139群霍乱弧菌 1992年，在印度印度马德拉斯、泰米
3、尔纳德发生的霍乱疫情，分离到的菌株不与O1群霍乱血清凝集，但是引起O1群霍乱的典型症状。引起WHO重视，定为O139群霍乱弧菌，被认为下一次霍乱大流行主角。,非O1群霍乱弧菌（O139霍乱）,生化特征与O1菌基本相同。 含有与O1群霍乱弧菌相同毒力基因 除O抗原不同外，其它性状均与EL-Tor生物型相似。 毒力蛋白及其调控因子与El-Tor霍乱具有高度同源的编码。 O139霍乱弧菌菌可以产生荚膜 与O1群霍乱无交叉免疫力 环境适应能力强 耐药性强,O139群霍乱弧菌的生物学特征,二、标本的采集与送检,概述： 标本采集： 病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其
4、他传播环节的标本：食物、水、环境类样品 监测：水样，水产品等 标本运送： 一般要求在6小时内室温（20-25 ）条件下送达实验室检测， C-B运输培养基（pH8.4）; （或文腊二氏保存液） 碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2） ： 培养基质量的保证：碱性胨水要澄清透明（表明未长细菌）、 8-10ml量要足。不符合规定，立即通知相关实验室或CDC更换。 便量合适：不要太少，不能太多（改变培养基的pH）。 送检及时：6h内送检。,1、粪便标本,（1）采样 逢疑必采 应在发病早期，服用抗菌药物之前完成，并尽快送到检验室。粪便标本采集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新鲜大便，也可用直肠棉拭或采便管由肛
5、门插入直肠内3cm-5cm处采取，水样便采取1ml-3ml，成型便采取指甲盖大小的粪便量。 病人的呕吐物，沾染粪便的衣服和用具，也可作为检材。,注意！,因腹泻病因复杂，霍乱轻型病例的症状与体征很不明显，不易与其他病因引起的腹泻相区别。因此，霍乱流行季节，逢泻必采是必须遵守的原则,（2）送检 剧烈腹泻病人的水样便含有大量病菌，直接分离培养不难检出阳性。条件允许的医院，通知实验室人员直接水样便接种四号平板培养。缩短检测时间。 不能立即检查的，要接种于培养基内，尽快送往检验室。送检标本可放入（PH8.6-9.0）碱性蛋白胨水（不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。），
6、也可放入文腊二氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基中。,水体的采样一般要求用灭菌的500ml 水样瓶采集相对静止的表层水 （水面30cm 以内）450ml，加盖密封后快速送检。取水点的选择应结合流行病学调查等资料确定，同时，采样时应选择在水流平稳或静止处吸取。非疫情状态下的监测采样时间一般在清晨时，此时水体未受人群活动等因素影响。,2、水样标本,水生动物的采样通常选取活的或新鲜的水生动物为采集对象， 有时也应考虑冰冻的水生动物，以无菌操作采集合适的部位，如鳃部和/或肠内 容物等，置采样瓶（管）或食品采样袋密封，在常温下送检。有条件的采样点可 将水生动物整体采回实验室再进行相关
7、处置。同时，要求以无菌棉签涂抹五只（条）以上的某类水生动物体表、鳃及/或肛门，置碱性蛋白胨水送检，每管碱性蛋白胨水作一份样品看待。,3、生物标本,增菌：碱性蛋白胨水（pH 8.6）作为增菌液； 分离：强选择性分离培养基（庆大霉素培养基或TCBS 培养基或4号培养基）分离；弱选择性培养基使用碱性琼脂或碱性胆盐琼脂。 应注意不同厂商以及不同批号培养基的质量，每批培养基在使用前必须进行质量检测。,三、霍乱弧菌的培养分离,挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大四号平板，第一板）。 第一管碱性蛋白胨水在 增菌小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大四号平板，
8、第二板），同时吸取0.10.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。 第二管碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号平板，第三板）。,分离培养要点（两管三板法）：, 经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良好后再次进
9、行玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）,可疑菌落的挑取,4号平板,TCBS 平板培养菌落形态（呈黄色）,染色镜检 革兰染色阴性的短杆菌 血清凝集试验： 分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 生理盐水不凝集，O1群血清
10、明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。 生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。 结合菌落特
11、征和菌体形态，作出初步报告。必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧菌可能同时存在，有必要对所有选出的菌株都进行凝集试验，以免遗漏。,四、霍乱弧菌鉴定-玻片凝集,霍乱弧菌的血清学鉴定要点,9cm平板，1划1，严禁1划2。 纯培养做血清学鉴定。 凝集，肉眼可见大颗粒。不要误判。 血清学凝集同时做盐水凝集对照，自凝菌排除。 血清学凝集覆盖O1与O139。 霍乱弧菌鉴定，以血清学为主，血清学凝集阳性即可初步报告。区别于肠杆菌科细菌（生化报告）。,进一步实验,氧化酶试验 1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液 粘丝试验 0.5去氧胆酸钠水溶液,进一步实验,生化鉴定 生化鉴定管： 发酵葡萄糖、
12、甘露醇、 蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+） 精氨酸双水解酶（-） 霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）； 生化鉴定条：梅里埃API 20E鉴定条等 全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2 COMP 全自动生化鉴定卡等 进一步分型鉴定(省CDC进行) 噬菌体分型 PFGE脉冲场分型,快速检测试剂盒,1荧光PCR O1群、 O139群双色荧光检测试剂盒 霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒 2胶体金技术,荧光PCR检测霍乱弧菌-初筛,检验程序,标本,增菌培养 碱性蛋白胨水,分离培养（TCBS、碱性平板）,生化鉴定分型,血清学鉴定,确诊报告,初步报告,快速诊断,直接涂片 动力、制动试验,TEL 0574-87274563 谢谢大家！,
