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1、贝类中微生物的检验,食品安全世界性的公共卫生问题,目前主要食品安全问题包括微生物引起的食源性疾病，农药残留、重金属、有机污染物等造成的化学性污染，以及非法使用食品添加剂等。 2000年腹泻引起的死亡报告数就达到210万。 发达国家每年1/3 的人患食源性疾病，发展中国家更加严重。 美国每年约有7600万例食源性疾病患者，30余万人入院，5000人死亡，损失350亿美元（1997年）。 根据WHO的估计，发达国家食源性疾病的漏报率90%以上，发展中国家为95%以上。 中国每年食物中毒例数至少20-40万人,细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30%-90%，中毒人数占食物中毒总人数的60%-9
2、0%。,致病菌的危害,细菌性微生物是人类食物链中最常见的病原，主要有大肠杆菌、沙门氏菌、结核菌、炭疽菌、肉毒梭菌、李斯特菌、葡萄球菌、猪链球菌、副溶血弧菌等。 食品感染通过活菌摄入引起人体（通常是肠道）感染 食物中毒预先在食品中产生的细菌毒素导致人类中毒 李斯特菌对胎儿危害极大，2004年导致107例死亡（欧盟，2005）。 沙门氏菌对禽类、生猪及其鲜肉制品的感染率最高，蛋类、禽类肉制品和猪肉是人类感染沙门氏菌病的主要渠道（欧盟，2005）。 在夏秋季节的沿海地区，由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒时有发生。 食品卫生的监控重点是对微生物污染的控制，只有从源头上切断食品
3、污染的渠道，才能有效控制食品安全问题的发生。,贝类微生物检验的主要指标,菌落总数,大肠菌群,沙门氏菌,副溶血性弧菌,单核细胞增生李斯特氏菌,贝类微生物检验的样品处理,采样部位为贝壳内容物。 先用流水刷洗贝壳，刷净后放在铺有灭菌毛巾的清洁的搪瓷盘或工作台上，采样者将双手洗净并用75%酒精棉球涂擦消毒后，用灭菌小钝刀从贝壳的张口处隙缝中徐徐切入，翘开壳盖，再用灭菌镊子取出整个内容物。 称取25g置灭菌乳钵内，用灭菌剪子剪碎，加灭菌海砂或玻璃砂研磨（有条件情况下可用均质器），检样磨碎后进行进一步的检验。,一、菌落总数测定,菌落（Bacterial colony）是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的
4、能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。 在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落(cfu)。 菌落总数（Aerobic bacteria count）是指在需氧情况下，37培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。 菌落总数也被称为杂菌数，需氧菌数等,并不表示实际中的所有细菌总数,因厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温细菌，难以繁殖生长。 菌落总数测定是用于判定食品被细菌污染的程度及卫生状况，它反映食品的生产过程是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。,检验程序(GB/T 4789.2-2003),菌落总数
5、,检验操作及要求,采 样 不应集中一点，宜多采几个部位，样品必须经过均质或研磨，以保证 取样均匀。 稀 释 为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使 其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。 在进行连续稀释时，吸管插入检样稀释液内不得低于液面2.5cm，吸取 液体时应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于三角瓶或试管的内壁使吸管内液体调至所要求的刻度。 当用吸管将检样稀释液加至另一空白稀释液时，应将吸管内液体沿管壁小心流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内。 样品稀释液主要是灭菌蒸馏水、灭菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、0.1蛋白胨水，磷酸盐缓冲液、 0.1蛋白胨水有修复食
6、品中受损伤的细菌细胞的作用，如对含盐量较高的食品（如虾油）可采灭菌蒸馏水稀释。,菌落总数,检验操作及要求,接 种 根据样品被污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易凝固，而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。 倾注培养基量约为12-20ml，一般以15ml较为适宜，平板过厚可能影响观察，太薄又易于干裂。 倾注时，应将有沉淀物的培基底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察结果。 为使菌
7、落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，旋转时应加小心，不要使混合物溅到皿边的上方。 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌死亡或繁殖。,菌落总数,检验操作及要求,培 养 琼脂凝固后应在数分钟内翻转并移至培养箱内培养，这样可避免菌落蔓延生长。必要时，可先将平皿打开倒置（皿底向上）于培养箱内，经15-60min使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置培养，可防止运动型强的变形杆菌属、假单胞菌属等在琼脂表面扩展生长。 培养温度一般为37（由于鲜冻水产品的生活环境水温较低，故多采用30的培养温度），培养时间一般为48h，当培
8、养于24h时也就观察生长状况。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。,菌落总数,检验操作及要求,菌落计数 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板暂时放置于0-4，但不得超过24h。 计数时可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 计数时应选取菌落数在30-300之间的平板，若有二个稀释度均在30-300之间时，应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取较小数字。 若所有稀释度均不在计数区间。 如均大于300，则取最高
9、稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之 如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30-300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之 有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告,菌落总数,检验操作及要求,菌落计数 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。 当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生
10、长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。 如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。,菌落总数,二、大肠菌群测定,大肠菌群（Coliform bacteria）并非细菌学分类命名，指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需
11、氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌属、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，该菌群主要来源于人及温血动物粪便，食品中大肠菌群的存在被认为是可能被粪便污染，从而推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。,检验程序 (GB/T4789.3-2003),大肠菌群,乳糖发酵,分离培养,证实试验,检验操作及要求,乳糖发酵试验 乳糖发酵试验是样品发酵的结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，
12、经过平板分离和证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵物有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。,大肠菌群,检验操作及要求,分离培养 初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。 由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板上大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较
13、大肠杆菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。 在该伊红美蓝平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色 菌落检出率较低。 如平板上出现较多典型大肠菌群菌落， 革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。 如平板上典型菌落甚少或均不够典型， 应多选择菌落做证实试验。,大肠菌群,检验操作及要求,最大可能数（MPN）是表示样品中活菌密度的估测。MPN法是采用三个稀释度九管法，稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测，较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，最高稀释度3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数，则应做一定范围的稀释度。,大肠菌群,三、沙门氏菌检验,沙门氏菌（Salmo
14、nella）广泛分布于自然界中，在人和动物中有广泛的寄主，能引起人类的伤寒、副伤寒和食物中毒等疾病，并引起动物的沙门氏菌病，是重要的肠道致病菌。沙门氏菌是一大群血清学上相类似的革兰氏阴性无芽胞杆菌，种类繁多，至1983年底已有2104个菌型。 沙门氏菌的分布极广，主要居于哺乳类、鸟类、两栖类和爬行类的肠道内以及被人或动物粪便污染的环境中，生肉和家禽常被这类菌污染，其感染率取决于物种、生产和加工过程以及从事于饮食服务行业的服务人员特别是炊事人员的带菌，可以造成食品污染而引起人类沙门氏菌感染导致食物中毒的发生。 贝类由于生活水域被污染感染沙门氏菌污染。海产品中的沙门氏菌一般比其他食品少得多。在各国
15、报道的感染沙门氏菌事件总数中，鱼和贝类受感染的情况只占很少一部分，但是也不容忽视。,生物学特性,革兰氏阴性较为细长的杆菌，大小0.4-0.91-3m，无芽孢，一般有鞭毛，无荚膜，多数有菌毛。需氧或兼性厌氧菌。 一般在普通琼脂平板上生长良好，形成中等大小、半透明的s型菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落。 生长温度范围为5-46，最适生长温度为35-37。最适生长pH为6.8-7.8。 100时立即死亡，70经5min或65经15-20min、60经1h方可被杀死。水经氯化物处理5min可杀死其中的沙门氏菌。,沙门氏菌,检验程序 (GB/T4789.4-2003),沙门氏菌,检验操作及要求
16、,前增菌 细菌受冷冻、加热、干燥、高渗、酸碱、辐射等的影响，可致亚致死性的损伤，如给予适当的营养和温度很快即能恢复到稳定的生理状态，故经过冷冻或加工的食品，一般要先经过非选择性的前增菌。用于前增菌的培养基为缓冲蛋白胨水和乳糖肉汤，两种培养基的效果无显著差异。 选择性增菌 未经加工的生食品或污染严重的食品，直接使用选择性增菌。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。选择性增菌培养基目前以亚硒酸盐胱氨酸增菌液、四硫磺酸盐煌绿增菌液和氯化镁孔雀绿增菌液为好。,沙门氏菌,检验操作及要求,分离培养 分离培养基通常用选择性培养基亚硫酸铋（BS）琼脂和鉴别性培养基胆硫乳（DHL）琼脂，此外还可用HE琼脂、WS琼脂和SS琼脂，分离效果依次递减。 生化反应 沙门氏菌检验必要的生化项目只有五项，即三糖铁、靛基质、pH7.2尿素酶、KCN和赖氨酸脱羧酶。对于H2S阳性的细菌，足以正确鉴别沙门氏菌属和柠檬酸杆菌属，对于H2S阴性的细菌，查表到B1时，只要补做ONPG试验，即可正确鉴别沙门氏菌属和埃希氏菌属。,沙门氏菌,DHL,沙门氏菌,BS,菌
