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1、药物毒理学,药物特殊毒性研究,周其冈,研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤、衰老及畸胎等,目的和意义：,药物特殊毒性研究,特点：,特殊毒性试验存在着种属差异性： 定性差异 定量差异,定性差异,反应停对家兔和种灵长类动物致畸，但至少对10种品系大鼠、15种品系小鼠、2种家狗、种田鼠和种灵长类动物不致畸 可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致畸 硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却引起脸和内脏畸形,定量差异,致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显 表 人类与动物致畸剂量比较 药物 最低致畸剂量（/kg/d) 人与动物比值 人 动 物 反应停 0.5
2、-1.0mg 兔 2.5mg 5-2.5 氨基喋呤 50g 大鼠 100g 2 氨甲喋呤 42g 大鼠 200g 4.8 乙烯雌酚 20-80g 恒河猴 200g 10-2.5 苯妥英钠 2mg 小鼠 50mg 25,内容：,遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性,药物特殊毒性研究,药物的遗传毒性,遗传毒性研究（Genotoxicity Study） 是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。 拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。,遗传毒性试验： 指用于
3、检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受 试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤 的固定 。 遗传毒性试验的用途： 主要用于致癌性预测。 遗传毒性试验的目的： 预测受试物是否有遗传毒性，降低临床试验受试者和药品 上市后使用人群的用药风险。,药物的遗传毒性研究,遗传毒性和致突变：联系、区别,药物的遗传毒性研究,目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进行添加或不添加代谢活化物质的试验，也可在整体动物上进行体内试验,根据试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类: 基因突变 染色体畸变 DNA损伤与修复,从试验系统
4、来分: 体内试验 体外试验,分类：,遗传毒性试验方法分类： 微生物回复突变试验 基因突变 哺乳动物培养细胞基因突变试验 果蝇伴性隐性致死试验 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 染色体畸变 啮齿类动物微核试验 啮齿类动物显性致死试验 精原细胞染色体畸变试验 程序外DNA合成试验 DNA损伤与修复 姐妹染色单体交换试验 SOS显色试验,检测终点,药物的遗传毒性研究,推荐的标准试验组合： （1）一项体外细菌基因突变试验。 （2）一项用哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤评估试验或体外小鼠淋巴瘤tk试验。 （3）一项用啮齿类动物造血细胞进行的体内染色体损伤试验。,原理 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合
5、成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。 S9混合液：,1.鼠伤寒沙门菌回复突变试验,微生物回复突变试验,（突变型）,（野生型）,正向突变,回复突变,受试物,S9混合物,鼠伤寒沙门菌His+ 鼠伤寒沙门菌His,试验菌株： TA97、TA98、TA100和TA102 剂量设计： （1）受试物至少应有5个剂量。 （2）最低剂量：1g/皿或0.1 g/皿,（3）最高剂量： 可
6、溶、无毒：5mg/皿 可溶、有毒：显示明显毒性，但不超过5mg/皿 难溶、无毒：产生沉淀的最低浓度，但不超过5mg/皿 难溶、有毒：多个产生沉淀的浓度，显示明显毒性，不超过5mg/皿,对照设置 溶剂阴性对照 （DMSO或者乙醇） 已知致突变原阳性对照,菌株鉴定 组氨酸营养缺陷鉴定 深粗糙型鉴定 uvrB缺失的鉴定 R因子鉴定,基因型鉴定,肝微粒体酶S9代谢活化系统： （1） S9诱导： 多氯联苯 500mg/kg 大鼠ip.,（2）S9的制备: 低温无菌条件制备肝匀浆 4 ，9000g，离心10min 上清即为S9。 （3）S9混合液： 平衡盐系统，其中含S9 530（v/v）,结果评价： R
7、t/Rc2，并有量效关系，判为阳性； 滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。,试验方法,（点试法）：,2.哺乳动物培养细胞染色体畸变试验,细胞: CHL、CHO、人外周血淋巴细胞等。 建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期检查核型和有无支原体等污染。-80或液氮冻存,剂量： 高剂量以50细胞生长抑制浓度为基准，最高不要超过10mM分子量。溶解受限时可采用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少个剂量,对照： 阴性对照溶剂 阳性对照已知致突变剂 对照: 代谢活化：肝微粒体酶S9系统,应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验 时间： 药物作用时间: 药物和细胞接触非活化组作用2
8、4h和48h收获细胞, 代谢活化组作用6小时以上 标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在24h和48h收获细胞（在1.5个细胞周期时收获细胞，若为阴性结果，作用时间可大于1.5个细胞周期),（2）读片分析：每种浓度至少观察100个中期分裂相，在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型 包括：染色体有无断裂、缺失、互换和裂隙 多倍体的出现 结果判定： 细胞畸变率有染色体畸变的细胞数/分析染色体的细胞总数100 细胞畸变率 结果判断 5 阴性（） 510 可疑（） 1020 弱阳性（） 2050 中度阳性（） 50 强阳性（）,注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致
9、死试验或精原细胞染色体畸变试验,正常染色体,畸变染色体,3.啮齿类动物体内微核试验,微核 （Micronucleus）：染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。,原理: 染色体畸变导致断裂 子代细胞主核之外的一个或多个颗粒（微核） 骨髓嗜多染红细胞：无核，易于鉴别微核 动物：小鼠 ，至少6只/组 各 5只/组 给药剂量及途径： 3个剂量，高剂量LD50/2 与临床拟用给药途径相同，一般单次给药。,对照：阴性对照溶剂 阳性对照如环磷酰胺 骨髓采样：
10、给药后1272h内 5个时间点 若无差别，给药后24h,涂片制备: 涂片 固定 染色 封片,镜检：,判定： 1.受试物所诱发的微核率的增加与剂量相关 2.某一测试点微核增加可重复并有统计学意义 符合上述一条即可判为阳性,注意： 1.对Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果的药物，必须用荧光染色以进一步肯定或否定阳性结果 2.不易通过骨髓屏障的药物，可补充用哺乳动物胎肝细胞微核试验进一步研究 3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择UDS试验或SOS显色试验,内容：,遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性,药物特殊毒性研究,致癌试验,致癌试验的目的 是考察药物在动物体内的潜在致癌作用，从而评
11、价和预测其可能对人 造成的危害。,由于致癌试验耗费大量时间和动物资源，只有当确实需要通过动物长期给药研究评价人体中药物暴露所致的潜在致癌性时，才应进行致癌试验。,任何体外实验、动物毒性试验和人体应用中出现的潜在致癌性因素均可提示 是否需要进行致癌试验。,动物致癌试验的结果与人体的相关性仍然存在一些争议，作用机制的研究对评价动物出现的肿瘤与人体的相关性是有价值的。当动物致癌试验出现阳性结果时，可能需要做进一步的研究，探讨其作用机制，以帮助确定是否存在对人体的潜在致癌作用。,历史背景 在日本，根据1990年“药物毒性研究指导原则手册”，如果临床预期连续用药6个月或更长时间，则需要进行致癌试验。尽管
12、连续用药少于6个月，如果存在潜在致癌性因素，也可能需要进行致癌试验。 在美国，大多数药物在广泛应用于人体之前，已进行了动物致癌试验。根据美国药品食品监督管理局（FDA）要求，一般药物使用3个月或更长时间，需要进行致癌试验。 在欧洲，“欧共体药品管理条例”规定了需要进行致癌试验的情况，包括长期应用的药物，即至少6个月的连续用药，或频繁的间歇性用药以致总的暴露量与前者相似的药物。 自2005以来，我国药品注册管理办法附件中规定预期临床连续用药6个月以上或需经常间歇使用的药物应进行致癌试验，并指出了进行致癌试验的多个考虑因素。2007年1月国家食品药品监督管理局药品审评中心发布的治疗用生物制品非临床
13、安全性技术审评一般原则中阐述了相关产品致癌试验的要求。 2009年10月药品审评中心组织毒理专家、企业和研究单位代表召开了制定“药物致癌试验必要性技术指导原则”专题讨论会，会上基本认同了ICHS1A中内容的适用性，并结合国内情况进行了一些调整。,为指导药物研究开发，国家食品药品监管局日前印发了药物致癌试验必要性的技术指导原则。指导原则阐述了何种情况下需要进行药物致癌试验，以避免实验动物资源、人力资源和物力资源的不必要使用。,致癌试验的指导性文件,指导原则适用于药品注册管理办法中的相关化学药，其基本原则也适用于中药、天然药物和生物制品。,提出预期临床用药期至少连续6个月的药物 某些药物存在潜在致
14、癌的担忧因素 当抗肿瘤药物拟用于非带瘤患者的辅助治疗或非肿瘤适应证长期使用时,适用受试物,对于化合物改盐、改酸根或碱基的情况，若已有原化合物致癌试验数据，应提供其与原化合物比较的药代动力学、药效学或毒性等方面无明显改变的证据。 当药物暴露量和毒性发生变化时，可能需进行桥接研究来确定是否需要进行新的致癌试验。 对于酯类和络合衍生物，上述类似数据对考虑是否需进行新的致癌试验是有价值的，应根据具体情况具体分析。,潜在致癌因素 如果某些药物存在潜在致癌的担忧因素，可能需要进行致癌试验。 应慎重评价这些潜在致癌因素，因为这是大多数药物进行致癌试验的最主要理由。应考虑的几个因素包括： （1）已有证据显示此
15、类药物具有与人类相关的潜在致癌性； （2）其构效关系提示致癌的风险； （3）重复给药毒性试验中有癌前病变的证据；（4）导致局部组织反应或其它病理生理变化的化合物或其代谢产物在组织内长期滞留。,用于晚期全身肿瘤的抗肿瘤药物，通常不需要进行致癌试验。 对于替代治疗的内源性物质（浓度在生理水平），尤其是 当同类产品（如动物胰岛素、垂体来源的生长激素和降钙素） 已有临床使用经验时，通常不需要进行致癌试验 系统暴露量非常小的局部用药不需要以经口给药途径来评价 其对内脏器官的潜在致癌作用，若有潜在光致癌性担忧， 可能需要进行皮肤给药致癌试验。 除非有明显的全身暴露或相关担忧，经眼给予的药物通常 不需要进行致癌试验 有致癌潜在，但是短期接触或非经常使用药物（麻醉/放射） 经化学合成、从动物或人体组织中提取纯化或生物技术方法 （如重组DNA技术）生产的内源
