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1、PCR技术及肿瘤三项应用,主讲人：赵晶晶 2015.7.31,PCR,PCR的基本原理 变性,复性,半保留复制 PCR三步曲 变性 9097 退火 4555 延伸 72左右,聚合酶链式反应： 是一种放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。,循环次数 DNA的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿,PCR循环次数与DNA产量关系,PCR特点：高效扩增、忠实复制,实时荧光定量PCR,是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。 实现了对DNA模
2、板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强，能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。,荧光定量PCR的临床应用,感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定 个体化用药指导,7,预警,遗传相关疾病,疾病相关遗传缺损,药物基因组学,关联分析,药物相关遗传缺损,预防,个体化治疗,HGP启动了个体化医学/基因组医学,治疗方法开发 基因治疗 药物治疗,人基因数：22,000 潜在药靶：22,000 现有药靶：500,8,个体化药物治疗的目的,避免药物不良反应,最大化药物效应,选择有效个体,EGFR基因突变检测 KRAS基因突变检测 BRAF
3、基因突变检测 二氢嘧啶脱氧酶（DPD）基因突变检测 UGT1A1基因多态性检测,PCR技术在肿瘤个性化治疗中的应用,肺癌居于我国恶性肿瘤死亡率之首，每年新增60万患者，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%。,EGFR 表皮生长因子受体; 是上皮生长因子细胞增值和信号传导的受体；与肿瘤细胞的增殖，血管生成，肿瘤侵袭，转移及细胞凋亡抑制有关。 KRAS 鼠类肉瘤病毒癌基因；是细胞信号内传导途径中的一种信号传导蛋白；像是体内的一个开关，正常时可以抑制肿瘤细胞生长，一旦突变，就会刺激细胞生长，打乱规律，从而导致肿瘤的发生。 BRAF 是一种癌基因，是EGFR通路中的重要转导因子，参与调控细胞生长，分
4、化和凋亡等多种生理过程。,肿瘤三项,12,TK,TK,细胞存活 (抗细胞凋亡),PI3-K,STAT3,AKT,MEK,基因转录,MAPK,细胞增殖 /分化,化疗/放疗抵抗,血管增生,肿瘤细胞迁移扩散,pY,pY,RAS,RAF,SOS,GRB2,pY,G1,S,M,G2,非小细胞肺癌(NSCLC) 组织中EGFR高表达； EGFR对肿瘤的增殖、分化、迁移等起重要作用 抑制EGFR活性可阻断下游的信号传导，抑制肿瘤细胞生长、转移和血管增生，促进肿瘤细胞凋亡,表皮生长因子受体（EGFR）,用于检测肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者肿瘤组织EGFR（表皮生长因子受体）基因的突变情况。 EGFR突变检测可
5、协助医生选择易瑞沙（Iressa，Gefitinib，吉非替尼)、特罗凯（Tarceva，它赛瓦；Erlotinib，厄洛替尼）等靶向药物的有效人群。EGFR突变的患者建议使用该类药物治疗，无突变者不建议使用该类靶向药物。,EGFR基因突变检测是NSCLC靶向用药的必检项目,K-ras基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是EGFR信号传导通路上的重要蛋白。 K-ras基因突变一般会使结直肠癌和肺癌患者络氨酸激酶抑制剂产生耐药。,判断肿瘤的发生发展、预后以及了解肿瘤的治疗效果： 正常人血中检出Kras基因异常，提示存在肿瘤易感性； 良性肿瘤患者检出Kras基因突变,提示有恶变的可能；
6、 Kras基因突变阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高； 美国国立癌症综合网络(NCCN)肿瘤临床指南及其中译版均明确指出：只有K-ras野生型患者才建议接受靶向药物的治疗，突变型患者不建议进行分子靶向治疗。 检测Kras基因突变可筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。,17,增殖,野生KRAS,EGFR,西妥昔单抗,细胞内,细胞外,细胞膜,野生型,K-ras野生型的EGFR通路,K-ras突变型的EGFR通路,CTGGTGCCG,Kras基因是RAS超家族中的原癌基因，其编码蛋白的激活/失活受控于上游EGFR信号。 单克隆抗体阻断EGFR和Kras
7、蛋白等下游信号传导通路，抑制和逆转肿瘤的发生和发展。,突变型Kras蛋白功能异常，无需EGFR活化信号刺激仍处于激活状态，且不可控而始终处于激活状态，导致肿瘤的持续增殖。 对抗EGFR药物治疗无效。,BRAF介绍及应用领域,黑色素瘤概况,恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为35。2010年全球黑色素瘤新发病例199 627例，死亡例数为46372例1。 虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例1。,1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版)，临床肿瘤杂志2012年2月
8、第17卷第2期,BRAF基因与黑色素瘤,检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9其中BRAFV600E是最常见的突变位点(87)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提供了理论基础1。 B-raf基因V600E突变导致抗EGFR抗体或EGFR酪氨酸激酶抑制剂类肿瘤靶向药物的耐药。 部分没有 K-ras 基因突变的患者也会对 EGFR靶向药物产生耐药性，研究证明这主要是由于K-ras 下游的 B-raf 基因 V600E 突变造成的,1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版) 临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期,B-raf 基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道，除了结直肠癌外，B-raf 在恶性黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌等均存在不同比例的突变。检测 B-raf 基因突变可用于指导EGFR-TKI 的靶向用药,谢 谢,
