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1、生物被膜与细菌耐药及 控制策略,卫生部临床检验中心 胡继红 2008.08.,细菌对抗菌药物的耐药性是自然界的抗生现象。 每一种抗菌药物进入临床后伴随而来的是细菌的耐药，即细菌在高于人类接受的药物治疗剂量浓度下能生长繁殖。 这种耐药可能与整个种的固有特性有关(天然耐药)，也可能敏感菌种通过变异或者基因转移获得（获得性耐药）。 耐药基因决定了各种各样的机制，使细菌抵抗特定抗菌药物的抑制作用。,细菌耐药性变异的趋势,近年来临床上发现的耐药细菌的变迁有以下6个主要表现： （1）耐甲氧西林的金葡菌（MRSA）感染率增高； （2）凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）引起感染增多； （3）耐青霉素肺炎链球菌（PR
2、P）在世界范围，包括许多国 家和地区传播（大叶性肺炎）； （4）出现耐万古霉素屎肠球菌（VRE）感染； （5）耐青霉素和耐头孢菌素的草绿色链球菌（PRS）的出现（细菌性心内膜炎）； （6）产生超广谱-内酰胺酶（ESBL）耐药细菌变异。,第一届卫生部全国细菌耐药监测中心网 (2005-2006 Mohnarin),全国17家医院；收集菌株4075株； G- : 3150(77%) G+ : 925 (23%) 葡萄球菌占: 536 (58%) MRSA： 63%、 MRSE: 83% 肠球菌占: 27%(249) 耐青霉素粪肠球菌:23%; 耐青霉素屎肠球菌:90% 5株对万古中介的肠球菌,未见
3、耐万古肠球菌,医院内感染中主要革兰阴性杆菌的耐药,对FQs 的耐药率高达 70% 对3-4代头孢菌素耐药机制几乎全为ESBLs 其中头孢吡肟和头孢他啶保持了高效,绿脓假单胞菌,全球关注的多重耐药（表型）的阳性球菌,社区获得MRSA (CaMRSA) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （HaMRSA)（医院获得） 耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRSCons） 万古霉素耐药的金葡菌（全球6株，中国0%） 万古霉素耐药的肠球菌（美国最高17%中国0-5%）,细菌耐药的遗传学机制,1 染色体介导的耐药,细菌固有的耐药性（天然耐药）或通过染色体突变产生的耐药性,与细菌的遗传和进化密切相关。 自发基因突变的现象
4、可导致细菌某些表型和功能的丧失，或获得新的功能，以对抗抗生素的作用。是同属细菌的共同特征，如肠球菌耐头孢菌素类药物。 对于耐药性而言，如果编码抗菌药物作用靶位的核苷酸发生点突变，导致转录的靶位蛋白空间构象发生改变，结果使药物与靶位之间的结合力下降或丧失，而使细菌产生耐药性。,倪语星，洪秀华主编。细菌耐药性监测抗感染治疗。人们军医出版社，2002年,细菌耐药的遗传学机制,2 质粒介导的耐药 目前该类耐药在临床上占有重要地位 质粒可以通过接合或转导作用在不同的细菌之间进行转移。 对抗生素具有较强水解作用的AmpC酶(AmpC -lactamase )、 超广谱-内酰胺酶(extended-spec
5、trum -lactamases， ESBLs) 碳青霉烯酶等,细菌耐药的遗传学机制,3. 转座子介导的耐药性 转座子(transposon，Tn) 在染色体、或在同一细胞中的染色体与质粒间移动， 使结构基因的产物大量增加，从而使宿主细胞失去对抗菌药物的敏感性。 Tn还可以使位于染色体上和非接合质粒上的基因转移到接合质粒中，因此实现细菌间的基因转移或交换。 整合子 可移动，可捕获和整合细菌的耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起到了至关重要的作用。 整合子可在不同细菌中水平传播，在同一类整合子上可携带不同的耐药基因盒，同一个耐药基因又可出现在不同的整合子上。细菌的耐药基因可以在不同的整合子中移
6、动，介导多重耐药的形成。,细菌耐药生物化学机制,（一）细菌产生灭活酶或钝化酶 使抗菌药物失活或结构改变； （二）细菌药物作用靶位改变或数目改变 使之不与抗菌药物结合； （三）细菌细胞膜渗透性改变 使之不能进入菌体内 （四）细菌主动药物外排机制 将药物排出菌体之外 （五）细菌生物被膜的形成,这些耐药机制不是相互孤立存在的，两个或更多种不同的机制相互作用决定一种细菌对一种抗菌药物的耐药水平。,不同类抗生素的常见耐药机制,-内酰胺类：细胞壁通透性降低；与PBPs(青霉素结合蛋白)亲和力与结合率降低；产生-内酰胺酶；细菌自溶酶缺乏。 氨基糖甙类：细胞膜主动传递中摄入减少；产生钝化酶；核糖体30S亚基蛋
7、白改变；Eh（氧化还原电位 ）和pH均可降低活性。 喹诺酮类：细胞外膜OmpF（外膜孔道蛋白ompC、ompF ）量降低，使喹诺酮类摄入减少，同时细胞膜传透通道改变，外流加快，细菌内积蓄减少；DNA旋转酶A亚基蛋白改变。 大环内脂类：核糖体50S亚基改变；局部pH可降低活性。,四环素类：药物外流加快，在细菌体内积蓄减少；核糖体30S亚基改变；产生灭活酶。 氯霉素类：细胞膜摄入减少；产生氯霉素乙酰转移酶。 林可霉素类：核糖体50S亚基改变，细菌产生灭活酶。 肽 类：如万古霉素，细菌不易产生耐药性，但也可由靶位改变而产生耐药。 磺胺类：改变二氢叶酸合成酶的结构；增加磺胺的拮抗物PAPA的产量。,细
8、菌生物被膜引起的 耐药,体外药敏试验体内敏感性,？,细菌生物被膜（Biofilm,BF）,群居,Community,互助求生存,BF是细菌为适应自然环境而形成的; 系细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质，将其自身包绕其中形成的膜样物； 生长于BF中的细菌，无论其形态结构、生理生化特性及对抗菌药物的敏感性等都与浮游生长的细胞显著不同，致病特点也不同。,细菌生物被膜耐药机制,C.A.Fus, European Society of Clinical Microbiology and Infectios Diseases, Volume 12,Number 4,April 2006,阻滞抗
9、生素的渗透； 吸附抗生素灭活酶，促进抗生素水解； 被膜下细菌代谢低下，呈“亚冬眠状态”，对抗生素的敏感性降低；低于致死量的抗菌药物又容易使细菌产生高度耐药性； 阻止机体免疫系统对细菌的清除，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗生素的协同杀菌作用。,导致,抗菌药物治疗失败是临床慢性感染反复发作、迁延不愈的原因之一。 对细菌生物被膜相关感染的治疗目前仍无有效的方法。,临床上容易形成生物被膜的致病菌,铜绿假单胞菌,容易吸附在体内黏膜表面形成生物被膜： 弥漫性泛细支气管炎、 囊性肺纤维化、 支气管扩张及慢性阻塞性肺疾病 黏液型铜绿假单胞菌总是难以彻底清除 ！,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌,在各种生物医
10、学材料如导尿管、大静脉导管、气管插管 等的表面形成生物被膜，导致所谓生物医学材料相关感染。,导尿管,金黄色葡萄球菌菌膜,菌膜外表面更促使黏附,BF相关感染的类型,生物医学材料相关感染有逐年上升的趋势,导尿管相关泌尿系统感染发生率为92%93%，约占院同感染的40%； 心脏外科生物材料（人工瓣膜）置入术合并感染发生率为33.3%； 90%的机械通气患者气管插管处有细菌定植并发复发生感染； 大静脉导管、伤口引流管、人工关节置入等相关感染的发生率亦较高。,导管相关感染 凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）,以表皮葡萄球菌为主，同时它也是医院内感染败血症的常见细菌（CNS中耐甲氧西林菌株） 可产生大量细胞间脂
11、多糖粘附素(polysaccharide Intercellular Adhesin，PIA)与细胞外粘液样物质(Extracellular Slime Substanece，ESS)，可通过不同途径吸附在导管表面，引致导管所致的感染。 动物实验已证实PIA、ESS具有干扰宿主防御功能，ESS可抑制B淋巴细胞的遗传性质、使合成免疫球蛋白减少；还可干扰吞噬细胞；可保护包埋在其中的葡萄球菌免受抗生素的作用，由于膜状物形成的生物膜 ，使得感染灶中细菌可以不断释放，从而引起败血症。,BF引起脑脊液分流术后感染,导管内表面,导管外表面,球菌和杆菌,C.A.Fus, European Society of
12、 Clinical Microbiology and Infectios Diseases,Volume 12,Number 4,April 2006,控制BF引起细菌耐药的策略,、抑制生物被膜的形成,在治疗过程中尽量选用能透过生物被膜的杀菌剂。 喹诺酮类药物：氟罗沙星、加替沙星等对细菌生物被膜有较好的渗透性， 对生物被膜下生长缓慢的细菌也有的杀菌作用； 大环内酯类药物：克拉霉素、阿齐霉素、罗红霉素等可抑制细菌生物被 膜的形成，与氟喹诺酮类药物联用时，可提高后者对细 菌生物被膜的渗透性和对被膜下细菌的杀菌活性。,微生态制剂主要有三类: 即益生菌(probiotics) ,如双歧杆菌和乳酸杆菌等
13、; 益生元(prebiotics) ,如双歧因子和各种寡聚糖等; 合生元(synbiotics) ,即益生菌和益生元同时并用的生态制剂。 （李彤，庄辉，中华微生物学和免疫学杂志2002 年5 月第22 卷第3 期）,抑制细菌生物被膜形成 采用抗藻酸盐血清或藻酸盐单克隆抗体、蛋白水解酶 金黄色葡萄球菌( S . aureus ) 转肽酶( sor2tase) 细菌表面蛋白的分泌定位有关（存在于G菌中） 该酶缺陷株不能正常表达表面蛋白,从而大大减弱诱变株对宿主的粘附性和致病性。 新药目标：转肽酶、EPS 和细菌密度感应信号系统 （干扰、降解已形成的EPS 和AHL） 特点不杀死细菌,只破坏细菌在宿
14、主体内的粘附、定植和形成保护性的BF 优点细菌发展抗药性的环境压力较弱,不易产生抗药性。 Mazmanian SK, Liu G, Jensen ER , et al . Staphylococcus aureus sortase mutants defective in the display of surface proteins and in the pathogenesis of animal infections. Proc Natl Acad Sci USA , 2000 , 97 : 551025515.,3、改进生物医学材料（抗细菌粘附）,对于生物医学材料相关感染，可通过 改进生物医学材料防止细菌生物被膜形成； 各种临床应用的导管、插管和医用合成材料。表层镀 银的合成材料可预防BF 污染心脏人工瓣膜和导尿管等。 应用超声、弱电流等方式清除细菌生物被膜。,（李彤，庄辉，中华微生物学和免疫学杂志2002 年5 月第22 卷第3 期）,谢谢！,
