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1、第2章 光谱分析法引论,主要内容（了解）： 光学分析法与光谱分析法的定义 光谱分析法的分类：分子光谱、原子光谱 发射光谱、吸收光谱 光谱仪器的结构： 光源、单色器、吸收池 检测器、显示系统,光学分析法（optical analysis）:根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用而建立起来的一类仪器分析方法。,能源提供能量,能量与被测物相互作用,产生被检测信号,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,4,电磁辐射与物质相互作用的方式有吸收、发射反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振等。,常见电磁辐射与物质作用的术语,吸收：原子、分子或离子吸收光子的能量，从基态跃迁至激发态的过程。 发射：物
2、质从激发态跃迁回基态，并以光的形式释放出能量的过程。 散射：光通过介质时，光子与介质分子之间发生碰撞，导致光子运动方向改变。,折射和反射:当光从介质1照射到与介质2的界面时，一部分光在界面上改变方向返回介质1，称为光的反射；另一部分光则改变方向，以一定的折射角度进入介质2，称光的折射。,干涉：在一定条件下光波相互作用，当其叠加时，将产生一个其强度视各波的相位而定的加强或减弱的合成波。 衍射：光波绕过障碍物或通过狭缝时，以约180的角度向外辐射，波前进的方向发生弯曲。,2.1 光学分析法及其分类 (P67),由于各区电磁辐射能量不同，与物质相互作用的机制不同，因此所产生的物理现象亦不同，由此可建
3、立各种不同的光学分析法。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,9,光学分析法的分类,光谱分析法：基于物质的光谱建立起来的分析方法。测量物质与辐射能作用时，物质内部发生量子化的能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射的波长和强度。 非光谱法：基于物质与辐射相互作用时，测量辐射的某些性质，如折射、干涉、衍射等变化的分析方法。不涉及物质内部的能级跃迁。,光谱（物质的光谱）：当物质与辐射能相互作用，物质内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生的辐射能强度随波长的变化，所得图谱为光谱（spectrum）。,光学分析法,非光谱法,光谱法,分子光谱,原子光谱,吸收光谱 发射光谱 散射光谱,一、分子光谱法和
4、原子光谱法,分子光谱法是由分子中电子能级以及振动和转动能级的变化产生的，表现形式为带光谱,分析方法有：UV-Vis、IR、MFS、MPS,原子光谱法是以测量气态原子或离子外层或内层电子能级跃迁所产生的原子光谱为基础的成分分析法，它的表现形式为线光谱。,分析方法有：AES、AAS，AFS、XFS,nm,原子光谱为线状光谱,分子光谱与原子光谱,分子光谱为带状光谱,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,15,二、发射光谱法和吸收光谱法,物质的原子光谱与分子光谱，按其获得的方式不同可分为发射光谱和吸收光谱。,（一）发射光谱法 物质通过激发过程获得能量，变为激发态原子或分子M* ，当从激发态过渡到
5、低能态或基态时以辐射的方式释放能量，产生发射光谱。 M* M + hv,通过测量物质发射光谱的波长和强度进行定性和定量分析。,1. 射线光谱法 天然或人工放射性物质的原子核在衰变的过程中发射和粒子后，使自身的核激发，然后核通过发射射线回到基态。测量这种特征射线的能量（或波长），可以进行定性分析，测量射线的强度（检测器每分钟的记数），可以进行定量分析。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,18,r计数器,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,19,液体闪烁计数器（计数器）,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,20,放射测定法在医学检验中的应用例子：,放射免疫测定法：激素及代
6、谢产物 肾上腺素（E）、 去甲肾上腺素（NE） 甲状腺激素（T3T4） 蛋白质和肽类激素（催产素、生长激素） 放射测定法：菌血症、菌尿症诊断、菌种鉴定、分枝杆菌快速培养及抗菌素敏感试验,2. X射线荧光分析法,原子受高能辐射激发，其内层电子能级跃迁，即发射出特征X射线，称为X射线荧光。用X射线管发生的一次X射线来激发X射线荧光是最常用的方法。测量X射线的能量（或波长）可以进行定性分析，测量其强度可以进行定量分析。,X射线荧光光谱仪,3. 原子发射光谱分析法（AES） 用火焰、电弧、等离子炬等作为激发源，使气态原子或离子的外层电子受激发发射特征光谱。波长范围在190 900nm。,广东医学院分析
7、中心,仪器分析光谱分析法导论,24,AES在医学检验中应用,血液电解质：Na、K、Ca、Cl、P、Cu、Zn、Mg、Fe ,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,25,等离子体发射光谱仪 (ICP),4. 原子荧光分析法,气态自由原子吸收特征波长的辐射能后，原子的外层电子 从基态或低能态跃迁到较高能态，约经10-8 s，又跃迁回基态或低能态，同时发射出与原激发波长相同（共振荧光）或不同的辐射。 波长在紫外和可见光区。在与激发光源成一定角度（通常为90）的方向测量荧光的强度，可以进行定量分析。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,27,原子荧光光谱仪光路图,5. 分子荧光分析法 某
8、些物质被紫外光照射后，物质分子吸收辐射能而成为激发态分子，然后在回到基态的过程中发射出比激发光波长更长的荧光。 测量荧光的强度可作高灵敏度定量分析。荧光波长在紫外-可见光谱区。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,29,6. 分子磷光分析法 物质吸收光能后，基态分子中的一个电子被激发跃迁至第一激发单重态轨道，由第一激发单重态的最低能级，经系统间交叉跃迁至第一激发三重态（系间窜跃），并经过振动弛豫至最低振动能级，由此激发态跃迁回至基态时，便发射磷光。,原子发射光谱与原子荧光、分子荧光和分子磷光光谱的区别：,同样是发射光谱，但后三种方法是以辐射能（一次辐射）作为激发源，然后再以辐射跃迁（二
9、次辐射）的形式返回基态。,7. 化学发光分析法 由化学反应 提供足够的能量，使其中一种反应物分子的电子被激发，形成激发态分子。激发态分子跃迁回基态时，发出一定波长的光。其发光强度随时间变化。在合适的条件下，峰值与被分析物浓度成线形关系，可用于定量分析。 由于化学发光反应类型不同，发射光谱范围为400 1400nm。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,33,当物质所吸收的电磁辐射能与该物质的原子核、原子或分子的两个能级间跃迁所需的能量满足E = hv 的关系时，将产生吸收光谱。根据物质对不同波长辐射能的吸收，建立各种吸收光谱法。 吸收光谱： M + hv M* 发射光谱： M* M +
10、 hv,（二）吸收光谱法,Mssbauer（莫斯鲍尔）谱法,由与被测元素相同的同位素作为射线的发射源，使吸收体（样品）原子核产生 无反冲的射线共振吸收 所形成的光谱。光谱波长在射线区。 从Mssbauer谱可获得原子的氧化态和化学键、原子核周围电子云分布或邻近环境电荷分布的不对称性以及原子核处的有效磁场等信息。,2.原子吸收光谱法,利用待测元素气态原子对共振线的吸收进行定量测定的方法。其吸收机理是原子的外层电子能级跃迁，波长在紫外、可见和近红外区。,原子吸收分光光度计,3.紫外-可见分光光度法 利用溶液中的分子或离子在紫外和可见光区产生分子外层电子能级跃迁所形成的吸收光谱，进行定性和定量测定的
11、方法。 波长范围200800nm,Uv3101紫外-可见分光光度计,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,40,UV-VIS在医学检验中的应用,血红蛋白测定：氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定法：540nm 十二烷基硫酸钠血红蛋白（SDS-Hb）测定法：538nm、540nm 尿液蛋白质检测：丽春红-S法：560nm 考马斯亮兰法：600nm 尿糖检测：葡萄糖氧化酶比色法：500nm,4.红外光谱法 利用分子在红外光区的振动-转动吸收光谱来对物质进行定性鉴别和结构分析的方法。 波长范围在2.525m,FT-IR,5. 核磁共振波谱法,在强磁场作用下，一些原子核产生核自旋能级分裂，当用一定频
12、率的射频照射分子时，可引起原子核自旋能级的跃迁，吸收一定频率的射频，产生核磁共振（NMR）。,以核磁共振信号强度对照射频率（或磁场强度）作图，即为核磁共振波谱。利用该方法可进行结构测定、定性及定量分析。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,44,（三）Raman散射光谱 频率为 0 的单色光通过透明介质，在透射和反射方向以外出现的光称散射光。如果这种散射是光子与物质分子发生能量交换引起，即不仅光子的运动方向发生变化，它的能量也发生变化，则称为Raman散射。 Raman散射光的频率（m）与入射光的频率不同，称为Raman位移。Raman位移的大小与分子的振动和转动的能级有关，利用Ram
13、an位移研究物质结构的方法称为Raman光谱法。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,46,2.3 电磁辐射的性质,在“第三章 紫外-可见分光光度法”中再介绍,2.3 光谱仪器(P-9),用来研究吸收、发射或荧光的电磁辐射强度和波长关系的仪器叫做光谱仪或分光光度计。 光谱仪一般包括五个基本单元：光源、单色器、样品容器、检测器和读出器件。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,48,光源是提供足够的能量使试样蒸发、原子化、激发，产生发射光谱。,发射光谱仪结构示意图,吸收光谱仪结构示意图 由光源和单色器得到的待测组分的共振吸收波长，通过吸收池，被样品待测组分吸收，再被检测器接收，即可
14、测得其吸收信号。,ex: 激发光波长 em: 荧光发射波长,光源,样品,发射光 单色器,检测器,读出器件,荧光光谱仪示意图,单色器 激发光,ex,em,一、光源 要求：足够的输出功率（光强度）和稳定性。 光源有连续光源和线光源等。 连续光源：分子吸收光谱法 线光源：原子吸收和Raman光谱法。,仪器主要部件,1. 连续光源 连续光源是指在波长范围内发射强度平稳的具有连续光谱的光源。 （1）紫外光源 氢灯或氘灯：光谱范围为160375 nm。 氘灯的工作方式与氢灯相同，光谱强度比氢灯 大3 5倍，寿命也比氢灯长。,（2）可见光源 钨丝灯：波长范围为320 2500nm 氙灯：波长范围250 70
15、0nm。光谱强度大 （3）红外光源 能斯特灯、硅碳棒，通过电加热方式产生 连续辐射。,2. 线光源 （1）金属蒸气灯 汞灯：波长范围254 734nm 钠灯：波长589.0nm、589.6nm （2）空心阴极灯（HCL） 主要用于原子吸收光谱，能提供许多元素的特征光谱。,（3）激光 激光的强度高，方向性和单色性好，作为一种新型光源应用于Raman光谱、荧光光谱、发射光谱、fourier变换红外光谱等领域。,二、单色器 作用：将复合光分解成单色光或有一定宽度的谱带 组成：入射狭缝和出射狭缝、准直镜、色散元件 （如棱镜或光栅）,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,57,中阶梯光栅分光系统,
16、1. 棱镜 原理：由于不同波长的光在同一介质中具有不同的折射率，波长短的光折射率大，波长长的光折射率小。因此，平行光经色散后按波长顺序分解为不同波长的光，经聚焦后在焦面的不同位置成像，得到按波长展开的光谱。,2.光栅 光栅分为透射光栅和反射光栅。 光栅由玻璃片或金属片制成，可近似地将它看成一系列等宽度和等距离的透光狭缝。光栅光谱的产生是多狭缝干涉和单狭缝衍射两者联合作用的结果。,3.狭缝 狭缝宽度：影响单色性，用有效带宽S表示 S = DW 式中，D为线色散率倒数，W为狭缝宽度。,狭缝为光的进出口，狭缝宽度直接影响分光质量。过宽，单色光不纯，将使吸光度变值；过窄，则光通量变小，将降低灵敏度。狭缝宽度要恰当。,广东医学院分析中心,仪器分析光谱分析法导论,61,棱镜分光仪器入射光及出射光狭缝,背景简单，光谱干扰小：用大狭缝 背景复杂，光谱干扰大：用小
