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1、基因重組原理與技術,主講人: 陳建民 國立中山大學 生物科學系博士班,基因重組的定義,基因重組一般又可稱為基因工程, 是利用分子生物學的方法, 將某一基因剪接到另一段DNA上, 並使之表現 人類第一個基因重組實驗 完成於1973年,DNA是遺傳物質,DNA構造,染色體與DNA,人類共有23對染色體,染色體, 基因, 與DNA,DNA上有四種氮基 (A,T,C,G) 排成序列,每三個氮基構成一組密碼 若干個密碼可合組成一個有意義的序列,即稱為一個基因 一條染色體上有許多基因 (數百數千) 這些基因的共同表現即造成了一個生物體的外表特性,何謂基因重組 (遺傳工程)?,所有生物均有DNA作為遺傳物質
2、 (一些病毒可以RNA作為遺傳物質) 甲生物的DNA可以進入乙生物的細胞內並表現出遺傳特徵 用人為的方法將某基因剪切下來並植入其他生物細胞內, 以求新遺傳特徵表現的方法就稱為基因重組 (遺傳工程),DNA的切割,通常 DNA 可以被核酸限制脢 (酉每) 切割 不同的核酸限制脢所切割的位置也不相同 通常辨識 46 個氮基序列(palindrome 序列) 基因重組實驗時, 可按需要選取適當的核酸限制脢來進行 大多數的核酸限制脢, 是萃取自細菌 目前市面上可以買到上百種的核酸限制脢,DNA的切割,核酸限制脢的切割舉例,DNA的切割,核酸限制脢的切割舉例 以 BamH1 為例,各種不同的核酸限制脢及
3、其切割位置,基因重組,基因重組,膠體電泳原理 Gel Electrophoresis,DNA 膠體電泳裝置,DNA 膠體電泳步驟,各種DNA 電泳膠體的染色,DNA 膠體電泳觀察與分析,DNA 轉形 (DNA Transformation),將 DNA 導入細胞內並完成重組的過程 DNA 轉形方法: 1. 以 CaCl2 處理細胞 2. 電穿孔法 (electroporation) 3. 顯微注射法 (microinjection) 4. 微脂粒法 (liposome) 5. 利用病毒 (virus) 導入 6. 基因槍 (biolistics, gene gun, microprojecti
4、le bombardment,),DNA 轉形 (DNA Transformation),以 CaCl2 處理, 製造 compentent cell,DNA 轉形 (DNA Transformation),電穿孔法 (electroporation),DNA 轉形 (DNA Transformation),電穿孔法 (electroporation),DNA 轉形 (DNA Transformation),顯微注射法 (microinjection),DNA 轉形 (DNA Transformation),微脂粒傳送法 (liposome transfer),DNA 轉形 (DNA Tran
5、sformation),病毒載體轉殖 (virus vector) 1. 以病毒感染細胞的方式, 將所欲植入的基因攜入目標細胞內 2. 常使用的病毒載體: a. 反轉錄病毒 (Retrovirus) 可攜帶 8 kb b. 腺病毒 (Adenovirus) 可攜帶 810 kb c. 皰疹病毒 (Herpesvirus) 可攜帶 30 kb,基因轉形 (DNA transformation),基因槍 (Microinjectile Bombardment, Biolistics, Gene Gun),基因轉形 (DNA transformation),基因槍 (Microinjectile B
6、ombardment, Biolistics, Gene Gun) 1. 將 DNA 黏附在黃金或鎢質的“子彈”上, 以高壓氣體快速射入目標細胞內 2. 子彈速度高達 1760 公里 / 小時 3. 可穿透植物細胞壁,轉殖載體 (Cloning Vectors),細菌 質體 (plasmids) 噬菌體 (bacteriophages) 黏接質體 (cosmids) 植物 Ti 質體 (Ti plasmid) 哺乳類細胞 SV40 病毒 反轉錄病毒 (retrovirus) 腺病毒 (adenovirus) 皰疹病毒 (herpesvirus) 其他 人造酵母染色體 YACs (yeast a
7、rtificial chromosomes),轉殖載體 (Cloning Vectors),質體 (plasmids) 細菌細胞內除了具有一個環狀的染色體外, 尚可具有一些小環狀的DNA, 稱為質體 質體上也具有基因, 可使細菌具備一些額外的功能 質體可以分離出來, 作為遺傳工程用的基因載體,轉殖載體 (Cloning Vectors),質體 (plasmids),轉殖載體 (Cloning Vectors),質體 (plasmids) 舉例 1. 複製起始點 2. 篩選標記基因 通常為抗藥基因 3. 核酸限制脢切割位置,轉殖載體 (Cloning Vectors),噬菌體與 cosmids
8、舉例,轉殖載體 (Cloning Vectors),植物基因轉殖與 Ti 質體,轉殖載體 (Cloning Vectors),植物基因轉殖與 Ti 質體,轉殖載體 (Cloning Vectors),植物基因轉殖與 Ti 質體,轉殖菸草,轉殖載體 (Cloning Vectors),反轉錄病毒與動物基因轉殖,轉殖載體 (Cloning Vectors),人造酵母染色體 YACs (yeast artificial chromosomes),轉殖載體 (Cloning Vectors),人造酵母染色體 YACs (yeast artificial chromosomes),DNA Library
9、 的建立 與特定基因之篩選,將某一生物之基因組 (genome) 切碎, 將所有 DNA 碎片選殖到載體上並植入宿主細胞內, 此種組合便稱為該生物的 DNA library 爾後便可用 DNA 探針 (DNA probe) 自 DNA library 中篩選特定基因, 進行研究,DNA Library 的建立 與特定基因之篩選,DNA Library 的建立 與特定基因之篩選,DNA 探針,以探針篩選特定基因,DNA Library,DNA library 通常可區分為 genomic library 及 cDNA library 二種,Genomic DNA Library,Genomic
10、library 是將某一生物之完整基因組 (genome) 切碎, 將所有 DNA 碎片選殖到載體上並植入宿主細胞內 通常以大腸桿菌 (E. coli) 為宿主 選用的載體可為各種質體cosmids 或噬菌體,cDNA Library,某些生物 (例如動物或植物) 的基因組太大, 不適合做 genomic library 因此可針對一些特定組織的表現基因來做 library 即可 cDNA library 即是將某一特定組織的 mRNA萃取出來, 以反轉錄方式做出 cDNA 將 cDNA 選殖到載體上並植入宿主細胞, 即成為 cDNA library,cDNA 製作方法,cDNA Librar
11、y 的特色,cDNA library 中的基因不含有 intron 序列 cDNA library 中的基因均不含有基因調節因子 (regulatory elements), 例如 promoters 及 enhancers 等, 基因重組時可以另外自由選用合適的 promoter cDNA library 比 genomic library 大為精簡許多,真核基因內的 Intron 序列,真核基因內的 Intron 序列,南方墨點法 (Southern Blot Hybridization),聚合脢連鎖反應 (PCR) (Polymerase Chain Reaction),針對特定基因設計
12、一對引子(primers) 加熱基因使雙股 DNA 分離為單股 加入引子, 使之與基因前後端 DNA 區域結合 再以 DNA 聚合脢進行複製反應 反覆進行此循環, 可在短時間內將特定基因大量複製,聚合脢連鎖反應 (PCR) (Polymerase Chain Reaction),DNA 定序 (DNA Sequencing),1977 年發展出二種 DNA 定序方法 1. Allan Maxam & Walter Gilbert (Havard university) 2. Frederick Sanger (ddNTP法) (Cambridge University) 1985 年發展出 D
13、NA autosequcncer 1987 年第一台DNA autosequencer上市 1998 年PE Biosystems Inc. 發展出 Capillary sequencing machine.,DNA 定序 (DNA Sequencing),Maxam & Gilbert Method,DNA 定序 (DNA Sequencing),Maxam & Gilbert Method,DNA 定序 (DNA Sequencing),Maxam & Gilbert Method,DNA 定序 (DNA Sequencing),Sanger Method,DNA 定序 (DNA Sequ
14、encing),Sanger Method,DNA 定序 (DNA Sequencing),Sanger Method,DNA 定序 (DNA Sequencing),Autosequencer Method,DNA 定序 (DNA Sequencing),Autosequencer Method,蛋白質技術 膠體電泳,可以分子大小與攜帶電價來進行分離 1-D 或 2-D 二種方式 可以一蛋白質色帶或色點的大小定量 分離後的蛋白質可以切下進行定序,蛋白質技術 1-D 膠體電泳,蛋白質技術 2-D 膠體電泳,蛋白質技術 蛋白質定序 (Edman Degradation Method),蛋白質工程
15、 Protein Engineering,蛋白質具有三度空間的摺疊形式 改變蛋白質的形狀可以影響其功能 (例如增加穩定性, 使之可以抵抗分解 pH 溫度氧化等, 也可以改變一個酵素的活性) 可以電腦依據氨基酸序列, 模擬預測一個蛋白質的形狀與功能 通常透過基因突變, 來改變一個蛋白質的氨基酸序列 常用的一個方法是定點突變 (site-directed mutagenesis, 或oligonucleotide-directed mutatenesis), 其他尚有DNA cassette置換法及PCR法等,蛋白質工程 Protein Engineering,定點突變,蛋白質工程 Protein Engineering,DNA cassette 置換突變法,蛋白質工程 Protein Engineering,PCR site-directed 突變法,PCR site-directed mutagenesis,
