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1、DNA重组技术的原理及步骤,第五组：郑桂贤,一、发展历史,1951年，美国学者E莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒。 20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础 1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时，斯吉巴尔斯基在基因期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。 基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。,二、DNA重组技术的原理,1.目的基因的获取 2.克隆载体的选择与构建 3.外源基因与载体的连接 4.重组DNA导入受体菌 5.重组体的筛选 6.克隆基因的表达,三、 DNA重组
2、技术的步骤,1. 分：分离目的基因 2. 切：对目的基因和载体适当切割 3. 接：目的基因与载体连接 4. 转：重组DNA转入受体菌 5. 筛：筛选出含有重组体的受菌体,Recombinant DNA Technology,从细胞中分离出DNA,限制酶截取DNA片断,分离大肠杆菌中的质粒, DNA重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,重组体的筛选,（一）分：目的基因的获取,1. 化学合成法:较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物 、测序引物、 核酸杂交探针、定点突变 2. 基因组DNA 、cDNA 3. 聚合酶链反应,cDNA文库,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA
3、,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,克隆载体的选择和构建,理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点（广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安全性 常用克隆载体：质粒DNA、噬菌体DNA 、病毒DNA 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能；带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。 pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,质
4、粒载体,（二）切：对目的基因和载体适当切割,（1）与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具,限制性内切核酸酶,在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为类酶 识别序列呈回文对称,5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5,5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5,EcoR的识别序列,Hae的识别序列,（三）接：目的基因与载体连接,(三) 连接策略 1. 粘端DNA 间的连接 (1) 同一限制性内切酶切割位点连接 (2) 不同限制性内切酶切割位点连接 2. 平端DNA 间的连接 3. 同聚物加尾连接 4. 人工接头连接,粘端连接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG
5、C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,同聚物加尾连接,（四）转：重组DNA转入受体菌, 无性繁殖 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态. 方式: 转化、转染、感染,导入大肠杆菌 导入哺乳动物细胞,1. 氯化钙转化法 2. 电击法 3. 体外包装感染法 1. 显微注射法 2. 电穿孔法 3. DNA-磷酸钙共沉淀 4. DEAE-葡聚糖转染法 5. 病毒感染法 6. 脂质体介导法 7. 细胞融合法 8. 原生质体融合法 9. 微细胞介导法,（五）筛：筛选
6、出含有重组体的受菌体,直接选择法 间接筛选法 核酸水平 蛋白质水平 1. 抗药性选择 *1. 酶切图谱 免疫学的技术： *2. 核酸探针 SDS-PAGE、 2. 标志补救 *3. PCR Western blot 、 3. 分子杂交法 *4. 序列测定 ELISA 、放免、 免疫沉淀、 荧光抗体等,抗药性选择,2）标志补救（-半乳糖苷酶法）,（LacZ基因 ）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ酶,氨苄培养基,(六) 克隆基因的表达,原核表达体系表达载体的标准： 1. 含有大肠杆菌适宜的选择标志 2. 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子 3. 含有适当的翻译控制序列 4. 含有
7、合理设计的多接头克隆位点 真核表达体系 关键步骤是将重组DNA导入真核细胞,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,基因载体,目的基因,粘端连接 平端连接 尾接法,分 切 接 转 筛,总观,参考文章,张亚旭 DNA重组技术的研究综述 生物技术进展 2012年第2卷第一期 57-83 张洪渊 生物化学教程 第七章 Page479 王镜岩 朱圣庚 徐长法 生物化学下册 第40章Page580 百度百科 马克学 席兴宇 转化、转导、转染和感染的解析 生物学教学 2010（第35卷）第10期,谢谢观看,
