细胞培养研究生实习课幻灯片-韩汶延

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1、细胞培养 技术,临床医学研究中心 韩汶延,细胞培养技术 在现代医学和生物科学研究中应用广泛,第一节 基本知识 第二节 细胞生存环境、条件和代谢 第三节 基本技术（见视频）,第一节 细胞培养的基本知识,一、细胞培养的基本概念 二、培养细胞的类型及其特点 三、培养细胞的增殖过程,细胞培养cell culture （组织培养 tissue culture）概念,从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术。 始于20世纪初（1907年Harrison，1912年Carrel） 凹窝玻璃悬滴培养法,细胞培养的目的

2、与用途,科学研究：药物研究开发与基础研究 1、新药筛选； 2、疫苗研究与开发； 3、基因工程药物研究与开发； 4、细胞工程药物研究与开发； 5、单克隆抗体制备； 6、药物作用机理； 7、基因功能研究； 8、疾病发生机制研究,对细胞（组织）培养的评价,优点 1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。 2、便于用各种不同技术方法研究细胞。 3、培养细胞携带有体内细胞同等的基因组。 4、同时提供大量的生物学性状相似的实验对象。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。 因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的

3、结论。,体内、外细胞的差异,体内细胞： 机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊）,体外细胞： 失去机体神经体液调节和 其他类型细胞影响 细胞的许多外来信号被切断 特定分化基因表达减弱或停止 而进化中保守的增殖活动维持 （由特殊到一般） 与体内细胞结构和功能的差异 特征：失去原有形态，分化特性减弱 形态和功能趋于单一 一定代数后衰老死亡， 或发生转化， 获不死性而成为能无限传代,高度特化的结构和功能,培养细胞的类型及其特点,培养细胞的形态分类 根据是否附于支持物上生长的特性，分为贴附型和悬浮型。 1、贴附型 细胞贴附在支持物表面生

4、长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞（Anchorrage-dependent cells）。大多数细胞属此型。失去在体内特有形态。 成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型,成纤维细胞,人肾小管上皮细胞,多形型黄色瘤细胞,游走型巨噬细胞,2、悬浮型细胞（suspended cell type） 悬浮生长，单个分散或成团。各种源自血液的细胞、骨髓、脾细胞。,培养细胞的增殖过程,细胞增殖 细胞分裂形成子代细胞的过程。 增殖周期： 间期（ G1-S-G2 期）和有丝分裂期（M期） 群体中多数细胞处于间期，少数处于分裂期 间期持续时间较长，分裂期较短。,培养细胞的生命期,定义: 细胞在培养中持

5、续增殖和生长的时间。一般可分为原代培养期、传代期和衰退期. 原代培养：从体内取出细胞接种后到第一次传代。一般维持14周。 细胞系：原代细胞一经传代就成为细胞系（Cell line），进入传代期。此期在全生命期中持续时间最长，一般传1050代。随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期。(Hayflick 极限的概念) 衰退期：细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞死亡。 肿瘤细胞：无限细胞系，永久增殖。,Hayflick极限,体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代

6、次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。,培养细胞一代的增殖过程,传代： 培养容器中细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液的过程 一代: 细胞接种后到下一次传代的一段时间 细胞一代的三个阶段： 潜伏期、指数增生期、平台期 实验研究多在指数增长期进行,第二节 细胞生存环境、条件和代谢,-培养的细胞生存途径和物质代谢与体内细胞基本相同，随生存环境改变出现一定差异。,（一）环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。,(二)温度： 人哺乳动

7、物：36.50.5; 鸟类：38.5; 一般培养细胞对低温的耐受力比高温强，温度上升不超过39时,细胞代谢强度与温度成正比。 3940 1小时,受损伤的细胞可能恢复； 4142 1小时,严重损伤,个别细胞恢复； 43以上1小时，细胞全部死亡。,温度不低于0时,细胞代谢有影响,无伤害作用; 置于 2535，细胞能生存，但生长速度减慢； 放在 4 数小时,再放回 37 细胞仍继续生长。 细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时, 细胞因胞质结冰受损而死亡。,(三)气体环境 气体：氧气和二氧化碳 氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。 氧气分压199589975Pa,

8、适用于封闭式单层细胞培养; 开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95空气加5二氧化碳混合气体环境中。,（四）细胞生存所需基本物质 与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。,细胞耐酸比耐碱性大一些,在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒，而在偏酸性环境中更有利于细胞生长。为了维持培养液恒定的pH，最常用磷酸盐缓冲剂方法，如PBS、Hanks平衡液等。,1、糖 是合成某些氨基酸的原料； 经过乙酰辅酶A（CoA）合成脂肪； 经过糖解磷酸通路能合成核酸。 各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力, 其中葡

9、萄糖最强,半乳糖最低。,2. 氨基酸： 12种氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。,需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。这些维生素在常用培养基中已成为固定组成。 脂溶性维生素对细胞生长也有作用,一般从血清中得到补充。,3.促生长因子： 培养液除营养成分外，也需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。 胰岛素(1-10单位)促进细胞利用葡萄糖和氨基

10、酸； 氢化可的松(10-8-10-7M)促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率； 雌激素和雄激素，或使用黄体酮和氢化可的松对乳腺上皮细胞培养效果则更好。 血清 是提供生长因子和其细胞所需物质的来源。目前血清、各种组织和其它生物成分，用生物工程的方法提取并商品化。,4. 其它物质： 在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、锌、硒铜、锰等。 需要促细胞粘附物质其，作用是：有助于促细胞贴附在各种底物或支持物上生长。,5.人工培养基： 细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除注意到无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，是供

11、给细胞营养和保证细胞生长的物质。 培养基的种类分为半固体和液体培养基两类。 液体培养基：分为合成、天然和无血清培养基三种。,A合成培养基： 成分清楚,通过调节各种成分的数量和种类,再借观察细胞生物状况反应性变化,测定细胞与外界环境的适应能力。借以了解细胞生存条件,诱导细胞进行定向分化的等。 合成培养基在应用上广泛。,B天然培养基： 用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用牛血清。血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。 加入5血清：维持细胞不死或缓慢生长； 加入1020血清：细胞增殖生长。,血清的主要作用,提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。 补充培养液中没有或量不足的营养成分。

12、 含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。 提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。 有中和毒性物质保护细胞不受伤害。 提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。,血清存在的问题,存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。 成分不明确，影响对结果的分析。 不同动物、不同批次的血清和活性差别较大，使培养的结果不稳定。,C.无血清培养基： 培养基内加入促细胞生长因子，当前发现各种促细胞生长因子已达几十种。还有三碘甲状腺素、转铁蛋白及大鼠颌下腺粗提物。 具有促进细胞生长增殖的作用。,第三节 细胞培养的基本技术,一、细胞分离和原代培养 二、培养细胞的传

13、代 三、细胞计数 四、观察 五、细胞的冻存、复苏和运输 六、污染的检测和对策,一、细胞分离,细胞悬液：离心收集 组织块 1. 机械分散 2. 剪切分离 3. 消化分离 胰蛋白酶法 胶原酶法,二、培养细胞的传代 (subculture),原代培养的首次传代（数量、纯度） 细胞传代方法 贴壁细胞的传代 悬浮细胞的传代 细胞系的维持,细胞消化步骤,摇动培养瓶终止消化,倒掉细胞上清液,加入新鲜培养基培养,离心并分离细胞,洗涤细胞,细胞系的维持, 细胞系档案要记录好。 维持传代的规律性。 多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间的交叉污染。传代时所用器械要编号或做好标记，严禁交叉使用。 每一种细

14、胞系都应有充足的冻存储备，防止由于培养细胞污染等因素造成细胞系的绝种；另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变。,培养细胞观察,培养液 细胞生长概况 细胞形态变化 微生物污染 细胞活力检测 （0.4% taipanlan染）,细胞冻存的原理,在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，能导致细胞内发生一系列变化，如电解质浓度升高、渗透压改变、脱水等，能引起细胞死亡。向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在130以下低温中能减少冰晶的形成。溶解细胞时，

15、速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50后，细胞仍能生长，活力不受损害。,细胞复苏的方法,1、将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入3740水浴中使其在1min内融化。 2. 无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液移至离心管中，补加10ml培养液，5001000rpm低速离心5min，去上清（ DMSO 在常温下对细胞有毒，应在细胞复苏后尽量除去），用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37培养，次日更换一次培养液。待细胞生长至一定密度后即可传代。 冻存要慢，复苏要快,细胞复苏步骤,从液氮中取出冻存管,迅速放入 37C 水浴,将细胞转入无菌离心管,24h后观察培养的细胞,洗涤细胞,加入新鲜培养基，培养细胞,细胞悬液,单细胞层细胞,细胞的运输,1. 选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。 2 . 妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地， 对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。 3. 到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所 需的液量，置37培养, 次日传代。,微生物污染的途径,空气 器材 操作 血清 组织样本,培养细胞污染的概念,微生物 化学物质 细胞,