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1、基因工程,专题一,第一节 DNA重组技术的基本工具,专题一,1认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 2简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。(重、难点) 3简述基因工程中载体需要具备的条件。(重点),一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过_和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在_水平上进行设计和施工的，因此又叫做_。 二、DNA重组技术的基本工具 1工具简介 (1)“分子手术刀”_ (2)“分子缝合针”_ (3)“分子运输车”_,体外DNA重组,分子,DNA重组技术,DNA连接
2、酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,2限制性核酸内切酶 (1)来源：主要是从_中分离纯化出来的。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断开，因此具有_性。大多数限制酶的识别序列由_个核苷酸组成。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：_和_。前者是限制酶在它识别序列的_将DNA的两条链切开产生的，后者是限制酶在它识别序列的_切开产生的。,原核生物,磷酸二酯键,专一,6,黏性末端,平末端,中轴线两侧,中轴线处,3DNA连接酶 (1)分类：根据酶的来源不同，可分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为_；另一类是
3、从_中分离出来的，称为T4DNA连接酶。 (2)两种DNA连接酶的比较： 相同点：都缝合_键。,EcoliDNA连接酶,T4噬菌体,磷酸二酯,黏性末端,平末端,黏性末端,平末端,比较低,有一个至多个限制酶切割位点,有特殊的遗传标记基因,质粒,动植物病毒,结构简单,独立于细菌拟核DNA之外,自我复制,思维激活 1不同的限制酶具有不同的识别序列，说明限制酶具有什么特点？ 2作为运载工具的载体，要求必须对受体细胞无害，为什么？ 答案 1专一性 2载体如果对受体细胞有害，其一旦被导入受体细胞，就会影响受体细胞的生命活动，甚至破坏受体的生命活动。,一、对基因工程概念的理解,知识贴士：基因工程得以实现的理
4、论基础： 所有生物的DNA都是以4种脱氧核苷酸为基本单位，构成独特的双螺旋结构，这为不同种生物DNA拼接成功提供物质基础。 所有生物共用一套遗传密码子，为某生物的基因能够在其他生物细胞内正常指导蛋白质的合成提供可能。,二、基因工程的工具 1限制性核酸内切酶 (1)来源：这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)种类：迄今已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。 (3)特点：主要切割外源DNA，而对自身的DNA不起作用，达到保护自身的目的；只能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列；只能在特定的部位进行切割。 (4)结果：形成黏性末端或平末端。 (5)实质：使特定部位的两个核
5、苷酸之间的磷酸二酯键断开。,知识贴士： 若限制酶切割后形成的是黏性末端，则形成的两个黏性末端是反向重复序列。 大多数限制酶的识别序列为6个核苷酸组成，例如EcoRI、SmaI限制酶识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。,2DNA连接酶,以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，分析回答问题。,解析 分析以上4个DNA片段，可清楚分析出为平末端，连接酶应用T4DNA连接酶；为黏性末端且相同，连接时应用EcoliDNA连接酶。 答案 (1) 平 T4DNA连接酶 (2) 黏性 EcoliDNA连接酶,已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如右图
6、中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是( ) A3 B4 C9 D12,答案 C 解析 每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的黏性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的限制酶切后的片段不一样，如果将题图中的三个切割位点自左至右依次标为甲、乙、丙，只在甲处切，可产生两个片段，即a和右边的bcd段，如果只在乙处切，就有ab和cd段，如果只在丙处
7、切，就有abc和d段，在甲、乙两处同时切，就有a、b和cd段，在乙、丙处同时切，就有ab和c、d段，在甲、丙两处同时切，就有a、bc、d段三种片段，在甲、乙、丙三处同时切，就有a、b、c、d四种片段。所以本题应该选C。,3“分子运输车”载体 (1)作用：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。 (2)作为载体必须具备的条件： 具有一个或多个限制酶切割位点，该切割位点必须位于载体本身必需的基因序列之外。 能够自我复制或整合到染色体DNA上后随染色体DNA复制。 带有标记基因，便于筛选。,本身是安全的，不能对受体细胞产生危害。
8、 大小适中，便于操作。 但实际上，天然载体一般不会同时具备上述条件，所以在基因工程中需要对载体进行人工改造。现在所用的质粒几乎都是人工改造的。,质粒是基因工程最常用的载体，它的主要特点是( ) 能自主复制 不能自主复制 结构很小 是蛋白质 是环状RNA 是环状DNA 能“友好”地“借居” A B C D,解析 质粒存在于细菌和酵母菌等生物中，是一种很小的环状DNA，上面有标记基因，便于在受体细胞中检测。质粒在受体细胞中能随受体细胞DNA的复制而复制，能进行目的基因的扩增和表达。 答案 C,质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是( ) A质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上
9、B质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器 C基因工程操作中的质粒一般都是经过人工改造的 D质粒上碱基之间数量存在AGUC 答案 C,解析 基因工程使用的载体需有一至多个酶切位点，具有自我复制的能力，存在标记基因，对受体细胞安全，且分子大小适合。而自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。而质粒进入宿主细胞后不一定都要整合到染色体DNA上，如宿主细胞是细菌细胞则不需整合。质粒是小型环状双链DNA分子而不是细胞器，也不会有碱基U。,1与遗传有关的各种酶的比较,特别提醒：DNA连接酶和DNA聚合酶的作用都是催化形成磷酸二酯键，而不是氢键，氢键是分子间的
10、静电吸引力，不需要通过酶的催化形成。DNA连接酶只能在两个DNA片段间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有DNA片段上，且需要以一条DNA链为模板。目前发现的DNA连接酶不具有连接单链DNA的能力。,2限制酶在原核生物中的作用 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成一套完善的防御机制，以防止外来病原微生物的侵害。限制酶在细菌内会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。而限制酶不会切断自身DNA，是因为在原核生物细胞中，其DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。,目前基因工程
11、所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。 (1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_。,(2)pBR322分子中有单个EcoR I限制酶作用位点，EcoR I只能识别序列GAATTC，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端：_。 (3)pBR322分子中另有单个的BamH I限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复_键，成功获得了重组质粒，说明
12、_,(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。,(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(BamH I和Bgl)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。 (4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH I作用后，标记基因tetR被破坏，而不能抗四环素，故多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。,
