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1、生物合成及其调控,第36章,RNA的,一、DNA指导下RNA的合成,1958 年Crick提出的中心法则,(一) DNA指导的RNA聚合酶,原核生物的RNA聚合酶由2构成核心酶，为起始因子，因子引导RNA聚合酶稳定地结合到DNA的启动子上，不同的菌种因子的大小差别很大,不同的因子可以识别不同的启动子，亚基借助疏水作用与DNA结合,亚基是碱性蛋白，借助静电作用与DNA结合，构成RNA聚合酶的催化中心，亚基与启动子上游元件和活化因子结合，促进酶的装配，因子参与某些基因转录的终止。,真核生物的RNA聚合酶对-鹅膏蕈碱不敏感，转录45S rRNA前体，经加工产生5.8S rRNA，18S rRNA 和
2、28S rRNA； RNA聚合酶对-鹅膏蕈碱敏感，转录编码蛋白质的基因和大多数snRNA；RNA聚合酶 对-鹅膏蕈碱中等敏感，转录小RNA，包括tRNA，5S rRNA， snRNA和scRNA 。,转录的步骤,研究转录起点的方法:足迹法,(二) 启动子和转录因子,原核生物的启动子,不同的因子识别的启动子共有序列有所不同（表36-3）,真核生物RNA聚合酶启动子的共有序列,RNA聚合酶基本启动子的共有序列TATA位于-25至 -30，转录起始部位有一保守序列PyPyA*NT(A)PyPy, 其中的Py表示嘧啶，*表示+1位点。上游调控元件包括CAAT框，GC框和八聚体框等，位置不很确定，不同的
3、细胞可以有不同的上游调控元件，不同的上游调控元件与不同的转录因子相互作用（表36-4）。,真核生物RNA聚合酶启动子与转录因子的相互作用,真核生物RNA聚合酶前转录复合物,TFD是包含TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)和多种TBP联结因子(TBP-associated factor,TAF)的寡聚蛋白，可以与RNA聚合酶的C端相互作用。,TFB有两个结构域，一个结合TBP。另一个可以引进TFF/pol复合物,TFF有ATP酶，解螺旋酶，激酶等多种活性，可以使RNA聚合酶大亚基的C端磷酸化，引起构像变化，促进转录。还可以参与DNA损伤的修复。,E和H促进除F以外
4、的其他转录因子脱落，使转录由起始阶段进入延伸阶段。,黄色为TATA box的糖磷酸骨架，碱基对为红色，相邻的DNA片段为蓝色，马鞍形的TBP（绿色）结合在DNA的小沟，使小沟扩大，并使DNA轴弯曲约100o，使TATA序列解旋。TFD杂聚体的其它组分位于TBP上方，像骑在马鞍上的牛仔。所有真核生物的基因均依赖于TBP。,前起始复合物的结构。显示pol, TATA box, TBP, TFB(B) , TFE(E)的相对位置。转录起始于pol和TFE环绕的区域。,电脑构建的TFA-TBP-TFB复合物的结构。注意蛋白质引起的DNA上游和下游的错位。,RNA聚合酶的核心启动子位于-45至+20，上
5、游控制元件位于-180至-107，两部分均有富含GC的区域。转录因子UBF1可结合于两部分富含GC的区域，随后结合SL1四聚体蛋白（作用类似与原核生物的因子）。 RNA聚合酶的启动子有3种类型，基因内启动子有两种，一种由boxA-中间元件-boxC组成，转录起始时，TFA(一种锌指蛋白）结合到boxA上，然后 TFC（至少5个亚基组成的复合物）结合，后者促进TFB（含有TBP和另外两种蛋白质，能使RNA聚合酶正确定位）结合，并引导RNA聚合酶结合到起始位点上。 另一种由boxA-间隔区-boxB组成，转录起始时， TFC识别boxB，其结合区包括boxA 和boxB，然后依次引导 TFB和RN
6、A聚合酶的结合。第3类启动子位于转录起点的上游， RNA聚合酶可以结合到其中的TATAbox并起始转录，但其上游的邻近序列元件（proximal sequence element, PSE）和八聚体基序(octamer motif, OCT)会增加转录的效率。,转录的解螺旋方式,如果RNA缠绕在DNA双螺旋上，不会产生超螺旋，但通过这种模式解开双螺旋进行转录是不可能的。,拓扑异构酶可以解除超螺旋，使转录泡移动。,(三) 终止子和终止因子 大肠杆菌有两类终止子，不依赖于因子的为简单终止子，能形成发夹区，其中常有一段富含G-C区，终点前有一段寡聚U，可能提供RNA聚合酶脱离模板的信号，同时，寡聚U
7、容易从模板脱落。 依赖于因子的终止子发夹区不含富G-C区，其后也无寡聚U，在细菌中少见，但在噬菌体中广泛存在。因子为六聚体蛋白质，可结合在新合成的RNA链上，借助水解NTP的能量移动，RNA聚合酶遇到终止子时停止移动，因子追上来与其结合，促进RNA聚合酶脱落，并使RNA从模板脱离。 抗终止子可使终止子通读，促进其后的基因转录，噬菌体的前早期基因的产物N蛋白是一种抗终止子，可以使终止子通读，使晚早期基因表达，晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止子，能使晚期基因得以表达。 真核生物转录的终止了解不多。,识别终止子还需要NusA, NusB, NusE. NusG等因子参与，有关问题有待深入研究。,
8、转录的过程,1. 操纵子的结构和调控 原核生物的不少基因在加入诱导物后mRNA迅速合成，随之酶滞后合成。当去除诱导物时mRNA的合成很快停止，但酶的合成延迟停止。 1961年 Jacob & Monod 构建部分二倍体(lacI-/FlacI+) lacs为阻遏蛋白不可诱导性突变，其阻遏蛋白失去诱导物结合位点； lacI-突变的阻遏蛋白不能形成寡聚物； lacI-d突变的阻遏蛋白不能和DNA结合，且呈负互补(反式显性)； Oc操纵基因的突变使结构基因组成型表达。 由此提出操纵子学说。,二. 转录的调节控制 (一) 原核生物转录的调节控制,（1）大肠杆菌乳糖操纵子的结构,大肠杆菌乳糖操纵子的作用
9、方式,乳糖操纵子的降解物阻遏和降解物基因活化蛋白(CAP)的作用,CAP二聚体与DNA的相互作用引起DNA的弯曲。红色为与CAP相互作用的磷原子， cAMP为红色。,乳糖操纵子包括三个结构基因（Z、Y、A），三个调控基因（启动基因、操纵基因和CAP蛋白结合位点），以及一个调节基因。调节基因编码阻遏蛋白，阻遏蛋白与操纵基因结合可阻止RNA聚合酶对结构基因的转录。当乳糖存在时，由乳糖转化而成的别乳糖与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白与操纵基因解离，诱导基因的转录。但是阻遏蛋白脱离操纵基因而解除封闭后，如果没有CAP的作用也不能启动转录。细胞内葡萄糖缺乏、cAMP水平升高时，cAMP与CAP结合形成复合物
10、，并与CAP结合位点结合，可促进RNA聚合酶与启动基因结合并启动转录。所以，乳糖操纵子的诱导作用既需要乳糖的存在又需要葡萄糖的缺乏。当操纵基因突变后，阻遏蛋白即不能与操纵基因结合，结构基因会组成性表达。,（2）基因表达的调控方式,（3）araBAD操纵子的正调控和负调控,promoter,负调控蛋白,正调控蛋白,araBAD操纵子的作用机制,（4）大肠杆菌的色氨酸操纵子,邻氨基苯甲酸合酶,N-(5-磷酸核糖）邻氨基苯甲酸异构酶 吲哚-3-甘油磷酸合酶,烯醇式-L-（O-羧基苯氨酸）-L-脱氧核糖-5-磷酸,特点: (1) trpR(89)和trpABCDE(25)不连锁； (2) 操纵基因在启
11、动子内 (3) 有衰减子(attenuator) (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被前导顺序(Leader)所隔开。 调节： (1) Trp为辅阻遏物(corepressor) (2)阻遏物和RNA pol 在P,O重叠区产生竞争性抑制； (3)阻遏物的阻遏能力低，是LacR的1/1000； (4) trpO调节合成代谢，存在衰减作用。,色氨酸操纵子的阻遏物辨认三种操纵基因,色氨酸操纵子转录本前导区二级结构的变换,缺乏多种氨基酸则前导肽不能合成，转录被终止。,色氨酸含量很低，但不缺乏其他氨基酸时，前导肽的合成在色氨酸密码子处停顿，不形成终止子，转录可以完成。,1,2,3,4,有高浓度色
12、氨酸存在时，前导肽顺利合成，核糖体占据1和2，使3和4形成发夹结构，转录被终止。,色氨酸操纵子衰减作用的机制,几种氨基酸合成操纵子的衰减作用前导肽的氨基酸序列,2.生长速度的调控 营养丰富，温度适宜时，细菌的生长速度可以很快，在两个细胞尚未分裂的情况下，新一代的DNA已经开始合成，大肠杆菌的倍增时间为25分钟时，平均每个细胞的DNA分子为4.5个，核糖体的数目也很多。当营养严重缺乏时，细菌进入严紧控制状态，氨基酸的缺乏使细菌合成ppGpp或pppGpp，这一信号使细菌的大部分蛋白质合成停止，只合成对生存必不可少的少量蛋白质。,3.基因表达的时序调控 噬菌体基因表达的时序调控研究较深入，其50个
13、基因组成4个操纵子，即阻遏蛋白操纵子，左右两个早期操纵子和晚期操纵子，左向转录的为L链，右向转录的为R链，当噬菌体侵入宿主细胞后，前早期和后早期的基因首先表达，随后，若晚期基因表达，噬菌体进入裂解循环，若合成阻遏蛋白，则进入溶原状态。右早期操纵子的调节基因cro可抑制溶原型阻遏蛋白cI的合成，使噬菌体进入裂解循环，左早期操纵子的调节基因N的表达产物为抗终止子，使前早期基因的转录越过终止信号进入后早期基因，后早期基因包括左右早期操纵子的3个调节基因，c/c与建立溶原状态的阻遏蛋白的合成有关，Q调节基因的产物亦为抗终止子，使晚期基因表达，噬菌体进入裂解循环。 基因表达的时序调控是发育生物学的基础。
14、,(二) 真核生物转录的调节控制 1.顺式作用元件： 指可影响自身基因表达活性的DNA序列，包括：核心启动子，如 TATA 框；上游启动子，如 CAAT框,GC框；远上游顺序，如增强子，衰减子、 静息子，酵母的UAS（upstream activator sequences）等；特殊细胞中的启动子成分，如淋巴细胞中的Oct(octamer）和B。 2.反式作用因子： 转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用），或通过与其它调节因子的相互作用（蛋白质-蛋白质相互作用），反式激活另一基因的转录，可以分为3类； 通用反式作用因子，主要识别启动子的核心启动
15、成分，如TBP； 特殊细胞的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2； 同反应性元件（response elenents）结合的反式作用因子，如HSE（热休克反应元件，heat shock response element），GRE（糖皮质激素反应元件glucocorticoid response element）； MRE（金属反应元件，metal response element）；TRE（肿瘤诱导剂反应元件，tumorgenic agent response element)相应的反式作用因子。,3.几种真核生物promoter的结构,真核生物的promoter与增强子的距离和方向差别很大
16、，转录因子与增强子结合促进其与promoter靠近，并促进基因的表达。,金属硫蛋白的promoter由多个元件构成，特异应答元件如MREs（金属应答元件）和GRE（糖皮质激素应答元件）。BLEs元件（基础水平元件）与基础表达(组成性表达）有关，TRE 是一个肿瘤应答元件，可以被促肿瘤佛波脂如TPA(tetradecanoyl phorbol acetate,四癸基佛波乙酸脂)活化。AP为反式作用因子。,增强子通过蛋白质介导与promoter相互作用，形成的DNA环使增强子结合的特异转录因子与同promoter结合的转录因子及RNA聚合酶相互作用。转录因子与RNA聚合酶的蛋白质:蛋白质相互作用活化基因的转录。,蛋白质与DNA的双位点相互作用,几种蛋白质中的螺旋-转角-螺旋基序,4.DNA结合蛋白基序的结构 （1）螺旋-转角-螺旋基序二聚体与DNA的二重对称位点结合，辨认螺旋(红色)与DNA的大沟结合，另一个螺旋(紫色)帮助辨认螺旋锁定在特定的位
