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1、猪A型H1N1流感病毒焦磷酸测序方法,报告人：徐彪,内 容,焦磷酸测序技术在动物检疫中应用的意义 焦磷酸测序的原理 焦磷酸测序检测猪A型H1N1流感的操作过程,焦磷酸测序用于猪流感检测的意义,猪A型流感：猪可能作为禽、猪、人流感病毒传播中唯一的共同易感宿主，其呼吸道上皮细胞同时具有人、禽流感病毒的受体，所以猪流感病毒具有感染人的潜力并作为流感病毒的“混合器”,在禽猪人的种间传播中起到非常重要的作用。,焦磷酸测序用于猪流感检测的意义,从2009年3月开始，陆续在墨西哥和美国发现人感染猪甲型H1N1流感后改为A（H1N1）疫情，目前已很多国家发现疑似病例 ，我国也确诊了两例,焦磷酸测序用于猪流感检
2、测的意义,流感病毒在检测中存在的问题 传统的检测方法如病毒分离鉴定虽具特异性，但是检测周期特别长，常常需要两周或两周以上的时间，无法满足出入境检验检疫的需要； 国务院生物安全管理条例已经实施，按条例规定病原分离鉴定只能在相应级别的生物安全实验室内进行，但目前检验检疫系统内还没有经过认可的P3实验室用于动物检疫，也就是说使用病毒分离鉴定确证阳性结果属非法。,焦磷酸测序用于猪流感检测的意义,国务院病原微生物实验室生物安全管理条例第三章第二十三条规定 出入境检验检疫机构在实验室开展检测、诊断工作时，发现高致病性病原微生物或者疑似高致病性病原微生物，需要进一步从事这类高致病性病原微生物相关实验活动的，
3、应当依照规定经批准同意，并在取得相应资格证书的实验室中进行。 为贯彻条例的规定，开展检测工作和亚型鉴定，需杜绝直接从事病原的研究。从分子水平上进行工作的开展，符合生物安全条例的精神。,焦磷酸测序用于猪流感检测的意义,RTPCR、荧光RTPCR此类方法虽特异灵敏，但可能存在假阳性反应。 解决办法，目前对可疑结果一般采用RTPCR产物序列测定进行确证。,焦磷酸测序用于猪流感检测的意义,焦磷酸测序技术 分子诊断的黄金标准,特异性、灵敏性远远低于病毒 分离鉴定方法，可能存在假阳性反应。,实时荧光RT-PCR,RTPCR,测序确证遭遇瓶颈,瓶颈：DNA序列测定做分子克隆，需要样品量大周期长，口岸采样一般
4、采集咽喉试子，经实验前处理后，所剩样品较少，且病原含量较低，PCR产物量根本达不到传统测序所需要的量，无法进行测序工作。,本课题的主要技术手段焦磷酸测序,Pyro + Sequencing = Pyrosequencing,Pyrosequencing是将焦磷酸技术应用于DNA序列分析的新一代技术,分子水平上的研究最佳选择获得分子诊断的黄金标准基因序列测序,焦磷酸测序用于猪流感检测的意义,PPi,ATP,APS,Luciferin,硫酸化酶,双磷酸酶,荧光素酶,Pyrosequencing原理,DNA聚合酶,实时和定量序列分析结果,Sample sequence ：AGGCAG,Pyroseq
5、uencing焦磷酸测序技术的特点,Pyrosequencing焦磷酸测序技术的特点,实验设计灵活,Forward sequencing Reverse sequencing Multiplesequencing primers,试验设计理念,血凝素基因,神经氨酸酶基因,鉴于最新爆发H1N1甲型 流感病毒变异点较多， 特选取该株独有且变异点较为 集中的区域作为目标序列,实验步骤,PCR检测,双酶切检测,目的基因,阳性菌 测序,获得阳性克隆菌,BioFlux回收试剂盒回收,连接与转化,RT-PCR,引物设计,提取模板,灭活病原,提取质粒,M基因及亚型基因的质粒构建,采样及样品的处理,鼻腔拭子 肌
6、肉或组织脏器 应尽可能多保留一些样品，因为流感的特殊性，可能需要重复实验。,RNA提取,采用常规方法 试剂只要适合于RNA提取即可,试验进程（PCR）及电泳,直接进行H1、N1基因的PCR扩增 采用两步法 电泳检测PCR扩增结果 根据提供的扩增片段长度确定是否扩增到目标片段 如有杂带，可以增加纯化步骤,试验进程及结果,PCR,试样预处理,Pyrosequencing反应,实验流程：分离纯化单链,开机，并拿出试剂，在使用前，保证所有试剂都达到室温 混匀 磁珠，在Mixer上常温混匀10分钟，每样约3L加入结合缓冲液到50uL 将50 L标记有生物素的PCR产物与50 L链霉亲和素包被的磁珠混合，
7、在室温25 下振荡孵育20 min。 用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在纯水中清洗 30 s； 在70%乙醇中清洗5 s；变性缓冲液洗5 s；最后移到洗涤缓冲液中清洗10 s。 空吸附器放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80 烘箱2 min，再冷却到室温。,Instrument design,Reagent cartridge,96 well plate,CCD camera,X-Y drive,Ink jet delivery,Mixer and thermostat,Detection,Positioning,T,A,C,G,实验流程： Pyrosequen
8、cing检测,测序反应,测序反应在28 下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600 mbar/8 msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。,标准的结构,结果判定 猪甲型H1N1流感病毒的确定： H1和N1 RT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与H1、N1目标片段完全相同的，确定为猪甲型H1N1流感病毒亚型。 H1和N1 RT-PCR反应均为阳性的，H1和N1测序片段与目标片段有一个以上碱基不同定为可疑，进行HA或NA基因全序列测定，确定其亚型。 H1、N1 RT-PCR反应全部或有一个为阴性的判定为非猪甲型H1N1流感病毒。,标准的结构,结果判定 甲型H1N1流感病毒的确定 中确定为猪甲型H1N1流感病毒的样品，建议采用本标准附录B.3中的引物，按本标准的方法及判定依据进行甲型H1N1流感病毒鉴定。,Thank you!,
