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1、第二章 生物化学检验中的诊断酶学,KEY POINTS,1.List the factors that affect enzyme level in blood. 2.State the methods of enzyme activity measurement, and its effect factors. 3.State the physiological actions, tissue distribution, clinical signification, and methods of analysis of ALT，AST，GGT，LD，ALP，ACP，CK，AMS，LPS a
2、nd CHE，etc. 4.List the isoenzymes methods of analysis, and discuss the migration of CK. 5.List five additional important enzymes and state their clinical signification.,Major Objectives,掌握血浆酶病理性变化的机制；酶活性浓度测定的基本原理；酶活性浓度的测定方法；底物或产物浓度的检测；酶偶联反应法；工具酶与共通反应途径；标本及标本采集和处理因素、试剂及方法学因素、仪器因素的影响及控制；最适测定条件与条件的优化；体
3、液酶测定在临床诊断中的作用。,Major Objectives,熟悉正常血浆中酶的动态，影响正常血浆酶活性的自身因素和生物学因素；酶活性浓度的单位；体液中常见酶及同工酶的生物化学检验的测定方法、临床意义；酶学检测的应用；同工酶及其亚型检测的临床意义。 了解血浆中的巨酶及其他体液中的酶；酶质量浓度的测定方法和优缺点；同工酶及其亚型测定的常用方法。,Brief Contents,第一节 组织和体液中的酶 第二节 生物化学检验中酶的测定 第三节 体液中常见酶及同工酶的生物化学检验 第四节 酶学检测在临床上的应用,第一节组织和体液中的酶,本节内容,一、正常血浆中的酶 （一）正常血浆中酶的动态 （二）影
4、响正常血浆酶活性的自身因素 （三）影响正常血浆酶的生物学因素 二、血浆酶的病理性变化 （一）酶合成异常 （二）酶释放增加 （三）酶排出异常 三、血浆中的巨酶 四、其他体液中的酶,一、正常血浆中的酶,（一）正常血浆中酶的动态 （二）影响正常血浆酶活性的自身因素 （三）影响正常血浆酶的生物学因素,1.正常血浆酶的来源,根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，可将血浆酶分成血浆特异酶和非血浆特异酶两大类。,（1）血浆特异酶：,此类酶属血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用，是血浆固有的酶。如凝血酶原、纤溶酶原等，它们属于蛋白酶的凝血与抗凝血因子。它们大多数在肝脏合成，以酶原形式分泌入血，
5、在一定条件下被激活，引起相应的生理或病理变化。当肝功能减退时，可见血浆中这些酶活性降低。,（2）非血浆特异酶：,这类酶在血浆中浓度很低，并且在血浆中很少发挥催化作用。可进一步再分为： 外分泌酶，此类酶指来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如胰淀粉酶等。它们在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关。,细胞内酶，此类酶指存在于各组织细胞中，参与物质代谢的酶类。这类酶大部分无器官专一性，称非器官特异性酶；只有小部分来源于特定的组织，有器官专一性，称器官特异性酶。这类酶细胞内外浓度差异悬殊，病理情况下极易升高。红细胞、血小板、肌肉、心、肝、肾和中枢神经系统等是正常血浆中各种酶的重要来源。 其他酶，凡不属
6、于上述范围的酶，如骨型ALP等。,2.正常血浆酶的去路,一般认为，血液中酶的清除方式与其他血浆蛋白质类似，但是具体清除途径尚不十分明了。 血浆酶主要是在血管内失活或分解。 尿液则是小分子酶排出的途径。相对分子量78万的血浆酶，如胃蛋白酶原（相对分子量4.5万）可以从肾小球滤过并排出，但相对分子量较大的LD（13.5万）、ALP（8.9万）等则不能从肾小球滤过并排出。 由于血浆酶消失速率因人不同，因酶而异，故在诊断学中尤应注意各种酶的变化时间特点，以免误诊。,1.细胞内外酶浓度的差异,细胞膜内外的酶浓度差是驱使酶向外释出的动力。酶浓度差愈大，释出的速度愈快；反之则愈小、愈慢。细胞膜内外酶浓度差因
7、酶而异，且随组织不同而不同。如肝细胞内LD较细胞外液高3 000倍以上，而RBC中此酶为血浆的200倍。,2.酶的相对分子量,酶的相对分子量大小反映了酶分子的大小，是影响细胞内酶释出的关键，各种酶从胞内释出的速度与酶的相对分子量成反比。例如在AMI时，血中最先升高的CK分子量为8.5万，而分子量为12.5万的LD出现升高明显推迟。,3.酶的组织分布,含酶量高且血流丰富的组织器官，其细胞内酶进入血流的可能性较大。如AST、ALT和CK三种酶分别以心、肝和骨骼肌含量最丰富。测定血浆中某一器官内含量丰富又易释出的酶，能提高对该器官疾病诊断的灵敏度和阳性率。测定只存在于某一脏器的特异性酶，有助于提高对
8、该器官疾病诊断的特异性和减少假阳性。,4.酶在细胞内的定位和存在形式,定位于细胞溶胶的酶（如ALT）比其他细胞器内的酶（如线粒体中的 ASTm）更易透出细胞，有些酶在细胞内可能和结构蛋白结合，或以多酶复合物的形式存在，因而较难释出细胞。酶在细胞内的定位和存在形式是决定其诊断敏感性，也是了解病情轻重的重要依据。,5.酶的半寿期,酶失活至原来活性一半时所需时间称为酶的半寿期（T1/2）。半寿期可用来代表酶从血中清除的快慢。凡半寿期长的酶，在血浆升高的幅度大，维持时间长。,人体血浆常用酶或同工酶的半寿期比较,表02-2,1.性别,大多数血浆酶的男女性别差异不大，但少数酶，如CK、ALP及-GT等，男
9、性高于女性。因此不能以一个参考值作为判断标准。性别差异也见于同工酶，如年轻女性血浆LD1 含量明显高于老年女性和各种年龄的男性。,2.年龄,不少酶在儿童时期与成人有所不同，例如CK出生24小时内可为成年人的3倍，到婴儿时降为两倍，到青春期降到成年人值。ALP和ACP也有类似的情况。,碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的年龄差异（K-A法，IU）,表02-3,3.饮食与药物,虽然血浆中大多数酶不受进食的影响，测定酶活性不一定需要空腹采血。但饮食2h后，有些酶活性会增高，例如，ALT增高10%，AST增高20%。酗酒可损伤肝线粒体，引起血清GLD、AST、ALT和-GT活性升高。许多药物也可致酶水平升高，如服
10、用大量VitC后，血浆ALP、LD活性升高。,4.运动,剧烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如CK、LD、AST和ALT等活性升高，升高幅度与运动量、运动时间、运动频率及骨骼肌所含酶量有关。因此，抽血检验前不宜过度运动，以免引起误差。,健康人激烈运动停止后休息时的血浆酶活性的变化情况,5.妊娠与分娩,妊娠期出现一系列生理变化，也可引起一些酶升高。妊娠时胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LD、LAP和ALT（少数）等，引起血浆中这些酶升高。在妊娠后期（79月）更为明显。AST、LD及CK活性虽在妊娠期正常，但在分娩时因子宫肌肉强烈收缩，可导致活性升高；同工酶分析发现，除CK-MM外，C
11、K-BB亦增高，这些变化与心肌损伤无关。,二、血浆酶的病理性变化,（一）酶合成异常 （二）酶释放增加 （三）酶排出异常,（一）酶合成异常,酶合成异常包括合成减少和合成增多。 血浆固有酶大部分由肝脏合成，肝功能损害时，其合成酶的能力受损，血浆中相应酶减少，慢性肝病时更为显著。例如肝病时， LCAT、ChE和清蛋白一样，在血浆中的浓度均降低。 细胞对血浆酶的合成增加或酶的诱导作用是血浆酶活性升高的重要原因。如成骨肉瘤及佝偻病，可因成骨细胞增生，合成分泌更多的ALP而使血浆中此酶升高。,（二）酶释放增加,酶从病变（或损伤）细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制。炎症、缺血、坏死、创伤和肿瘤
12、等是细胞释放大分子酶蛋白的重要原因。 感染性炎症可引起细胞膜通透性增大。可能的原因是入侵微生物的代谢物（如毒素）直接损伤细胞膜；炎症时电解质浓度增大、渗透压升高、流体静水压改变，以及pH变化也可损伤细胞膜，使细胞内酶释出增加。,缺血均伴有缺氧，进一步可导致酸中毒和细胞水肿等。这些变化均能使细胞膜和线粒体膜破坏，溶酶体内大量的水解酶释出至细胞溶胶，直接作用于胞膜使其通透性升高，促进酶从细胞内向外溢出，但其速度和数量受多种因素影响。 溶酶体和线粒体内酶的释出，可引起细胞自溶，酶全部释出血流，故临床上在血液中测到含线粒体酶时，标志细胞已坏死，病情较为严重。,肌肉创伤、手术性大组肌群损伤、肌肉感染（如
13、严重蜂窝组织炎）、惊厥、癫痫发作、分娩，乃至肌肉注射，均可引起细胞内酶的直接释放，也涉及因缺氧增大细胞膜的通透性的间接影响。 肿瘤（主要是恶性肿瘤）引起血清或体液中某些酶活性升高，与肿瘤的代谢特点、血管因素、机械压迫、诱导作用、细胞膜的通透性改变等多种因素有关。,（三）酶排出异常,血浆中的淀粉酶（约占AMY总活性的24%）由肾脏排出。肾功能减退时，血浆AMY活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留所致。胆道梗阻时，血清ALP升高的原因是梗阻区ALP合成加强，ALP排泄受阻而逆流入血。但对于大多数酶而言，并不存在酶经肾脏或胆道排出异常而导致血清酶升高的这种清除机制。,三、血浆中的巨酶,血浆中有时可
14、出现相对分子质量远大于正常酶分子的一些酶，通常称为巨分子酶或酶的大分子形式，简称为巨酶（macroenzyme）。 血浆中的巨酶形式有巨乳酸脱氢酶（MLD）、巨肌酸激酶（MCK）、巨淀粉酶（M-AMY）、巨-谷氨酰转移酶（M-GT）、巨天门冬氨酸转氨酶（MAST）、巨丙氨酸转氨酶（MALT）和高相对分子质量碱性磷酸酶（HMW-ALP）等,四、其他体液中的酶,早在18世纪后期已经知道尿液中含有酶。由于尿液量大、易得，检测尿液酶及其同工酶不仅可以灵敏地反映机体脏器的病变，而且能反映泌尿系统有无损害、病变程度、感染部位及疗效等，故尿液酶及其同工酶的检测已成为诊断酶学的重要领域。此外，临床上还对脑脊液
15、、胸腔及腹腔积液、羊水、心包积液、消化液、支气管肺泡灌洗液、生殖系统分泌液、泪液、关节液和乳汁中的酶进行检测。,血液以外其他体液中常见的酶,（见表02-4）。,第二节 生物化学检验中酶的测定,本节内容,一、酶活性浓度的测定 二、酶质量浓度的测定 三、同工酶及其亚型测定 四、酶活性浓度测定的主要影响因素及控制,一、酶活性浓度的测定,酶活性浓度测定的基本原理 酶活性浓度的测定方法 底物或产物浓度的检测 酶偶联反应法 工具酶与共通反应途径 酶活性浓度的单位,（一）酶活性浓度测定的 基本原理,酶催化活性的途径,酶催化活性可通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率
16、来获得。 用这种方法获得的酶浓度的确切名称是“酶的催化活性浓度”或简称为“酶活性浓度”。,酶活性与反应速率的关系,若SKm，且S很大，米-曼氏方程式可简化为： 此时，酶促反应的最大速度只与酶催化活性或酶量E成正比例， 它是建立准确、可靠测定方法的基础。,酶促反应过程的分期,一个典型的酶促反应过程一般包括三个阶段。 延滞期（lag phase）、 线性期（linear phase） 非线性期（non linear phase）,酶促反应时间进程曲线,注意事项,要准确测定酶活性，必须了解不同酶反应速率和时间的关系， 找出酶促反应速率恒定的时间， 避开延滞期、非线性反应期。 传统的手工分析法无法在零级反应期测定，故结果不够准确。,（二）酶活性浓度的测定方法,酶活性浓度的测定方法,以反应时间为依据，酶活性浓度测定方法可分为两大类 定时法（fixed time assay） 连续监测法（continuous monitoring assay）,定时法,通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时
