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1、MHC & HLA检测,第二十七章 人类白细胞抗原分型法,目的要求： 掌握血清学分型法的方法及用途。熟悉细胞分型法和基因分型法的方法及用途。 教学内容： 1.血清学分型法 2.细胞分型法 3.基因分型,MHC是主要组织相容性抗原的编码基因,主要组织相容性复合物（ major histocompatibility complex MHC）,一、MHC,组织相容性系指在两个体间交换（移植）组织或器官的过程中, 组织或器官能存活者为相容； 组织或器官不能存活者为不相容即排斥,排斥反应是免疫反应 有潜伏期 有再次应答 有免疫效应物质 免疫抑制剂可减轻,决定排斥反应发生与否的抗原称组织相容性抗原， 其编
2、码基因即主要组织相容性复合物 MHC,不同物种的MHC,人 HLA 猩猩_ChLA 恒河猴_RhLA 狗_DLA 猪_SLA 兔_RLA 大白鼠_AgBH-1 小白鼠_H-2,二、HLA,(一).HLA基因,位于第6对染色体短臂 有类,类,类基因 现发现等位基因已逾1000 均为共显性遗传,DP DQ DR C4 C2 BF B C A,D,基因 抗原,类 类 类,着丝点 细胞膜,1.HLA基因命名,HLA基因 HLA-DR1*0401 HLA-DR1 * 04 01 基因座位 等位基因组 等位基因号 HLA抗原: HLA-DR4,人类MHC的等位基因,基因位点,等位基因数,基因位点,等位基因
3、数,HLA,-,A 151 HLA,-,DRA 2,HLA,-,B 301 HLA,-,DRB 282,HLA,-,C 83 HLA,-,DQA 20,HLA,-,DQB 43,HLA,-,DPA 87,HLA,-,DPB,2.HLA基因的多态性,现有特异性抗原164个 同一特异性中可有多个基因 等位基因近1000个,3.单倍型： 一条染色体上的基因，在一起分离，结合，传递 个体从父母亲各得到一条单倍型，故父母和子女间有一条单倍型相同 兄弟姐妹间两条单倍型完全相同占1/4 两条单倍型完全不相同的占1/4 一条单倍型相同占1/2,A/C,(二),几点说明: 编号原则:A,B座位混合编号,其他座位
4、独立编号 超型和亚型:超型发现在前,亚型发现在后,超型分裂成数个亚型 W: C座位是为了避免和补体混淆 D,DP座位抗原因是用细胞学方法检测的，不同于其他血清学检测抗原 BW4，BW6是HLA-B座位的共同抗原,两类HLA分子,类 位点 结构 分布 提呈功能 A,B,C 有核细胞 细胞内 D,DR,DQ,DP , B，mo， 细胞外 巨噬细胞,HLA-I类分子,HLA-II类分子,(三).HLA功能,移植抗原 参与提呈抗原, MHC限制性 参与T细胞的成熟:胸腺内的选择 参与免疫调节：作为KIR的配体,进入胸腺 PRO-T CD4-CD8- 在胸腺微环境中发育 Pre-T CD4+CD8+ 继
5、续发育 CD4+CD8+CD3+TCR+ 结合胸腺基质细胞 MHCI类 CD8+ MHCII类 CD4+ 结合 MHC+自身Ag 凋亡,NK细胞及某些 T 细胞表达的杀伤细胞抑制性受体(KIR)，对这些细胞的功能具有负调节作用，也是NK细胞识别正常与异常细胞的机制之一。 经典的HLA类分子和非经典类分子均可作为KIR的配体，参与免疫调节作用。,(四).HLA检测,HLA-A, HLA-B, HLA-C 抗原, HLA-DQ, HLA-DR 抗原可用血清学方法检测 HLA-D, HLA-DP抗原须用细胞学方法检测 现均可用分子生物学方法检测,1.血清学方法,补体依赖的细胞毒性试验(CDC) (1
6、) 材料 抗原:淋巴细胞 抗体:同种抗体或单克隆抗体 兔补体 伊红或荧光染料 福马林,(2)CDC原理:,阴性 阳性,补体,淋巴细胞,抗体,(3)CDC步骤,制备抗体盘,应含有已知常见抗体 1l 淋巴细胞悬液 5 l 补体(兔血清) 3 l 伊红或荧光染料 8 l 福马林 待细胞沉降后,用相差显微镜或荧光显微镜低倍观察,反应孔,抗体1l,1l 淋巴细胞悬液,5 l 补体(兔血清),3 l 伊红或荧光染料,8 l 福马林,CDC工作记录 血清编号 特异性 结果 血清编号 特异性 结果 NS - 1 287 A10 1 057 A1 1 007 A11 8 243 A2 8 735 A11 8 4
7、76 A2 8 125 A11/A33 8 T92 A2/B7 8 O35 A31 4 134 A9 4 376 A31/A30 2 231 A24 1 230 A33 1 E54 A24 2 243 A33 1 4T6 A24 1 ALS + 8,(4)CDC的技术要点,HLA抗体为同种抗体, 来自产妇或自愿免疫者, 检测类抗原需除去其中的类抗体, 现也可用单克隆抗体 检测类抗原用PBL或T细胞,检测类抗原需用B细胞，细胞的活率要高，应避免过多的红细胞或血小板的污染 检测类抗原时孵育时间延长,(5)CDC试验的用途,HLA定型：用已知抗体 HLA抗体筛选，鉴定：用已知抗原 交叉配合 群体反应
8、性抗体检测：用多个已知HLA型的细胞，检测受者血清能和多少个细胞反应，即抗体种类的多少,2.混合淋巴细胞培养(MLC),(1)原理: 两个体淋巴细胞在一起培养,如HLA不合,将引起增殖反应 淋巴细胞出现母细胞化 或摄入的标记的核苷增加，致CPM增高,1,2,3,4,刺激者 1,2 3,4 应答者 3,4 1,2 CPM CPM,(2)双相MLC,(3)单相MLC: 淋巴细胞经丝裂霉素或X射线处理失去增殖能力, 在MLC中, 仅能作为刺激者, 另一个体细胞成为应答者, 如已知刺激细胞的HLA-D抗原, 且是纯合子 (HTC) , 即可分型应答细胞,?,1,m,1细胞 能否使 ?细胞增殖,决定于它
9、们的HLA-D抗原是否一致 CPM 不增, ?细胞有1抗原 CPM 增高, ?细胞没有1抗原,PLT分型,3,2,3,4,3,4,2,预致敏淋巴细胞(PL),m,一单倍型相同的两个体淋巴细胞进行MLC, 则应答细胞增殖并保留免疫记忆,以PL为应答细胞, 待测细胞为刺激细胞进行MLC, 如待测细胞表达PL记忆的抗原, 则PL将迅速增殖,?,3,4 2,m,CPM 增高 有2抗原 CPM 不增高 没有2抗原,类型 刺激者 应答者 已知 时间 检测 阴性 HTC 待测 HTC 6天 D,DP 阳性 待测 PL PL 2天 DP,阴性分型法为初次免疫应答 阳性分型法为再次免疫应答,3.分子生物学分型法
10、,PCR-SSP:顺序特异性引物PCR PCR-SSO:顺序特异性寡核苷酸杂交PCR PCR-SSCP:单链构象特异性PCR PCR-RFLP:限制性内切酶片段长度多态性PCR PCR-DNA(SBT):DNA测序 除测序外上述方法均不能检出所有的等位基因,为此,可两种方法结合使用,DR1 DR2 DR3,样本 抽提的DNA 加顺序特异性引物 PCR扩增 EB染色 琼脂糖电泳 UV下观察,DR1 DR2 DR3,PCR-SSP流程,常用HLA基因分型法: 名称 特殊试剂 特殊过程 检测的多态性 SSP 顺序特异性引物 PCR/凝胶电泳 等位基因 SSOP 顺序特异性寡核苷酸 PCR/核酸杂交
11、等位基因 SBT 标记引物 / 标记的序 列末端 PCR / 测序 等位基因,(五)HLA分型的应用,基础免疫学研究:MHC限制性 器官移植: 排斥反应 与疾病相关性：B27与AS 与输血的关系：发热，血小板输注无效 人类学研究 亲子认定,1.HLA与疾病的相关性,家系研究: 观察有病者是否具特殊的单倍型 群体研究: 对比病人组和非病人组HLA 各个抗原频率的高低。计算相对危险性（RR =P+/P- C-/C+ ）。 如强直性脊柱炎和HLA-B27相关。RR可达90-300,HLA-B27 阳性 阴性 强直性脊柱炎 90 10 对照人群 5 95 RR=90 95/5 10=855/50=17
12、1,HLA与疾病相关性,疾病 HLA RR 强直性脊柱炎 B27 100 白塞氏病 B5 12 葡萄膜炎 B27 10 类风湿关节炎 DR4 4.2 胰岛素依赖性糖尿病 DR3/DR4 25 多发性硬化 DR2 5,A/B C/D,A/C A/D A/C B/C E/F,B/F,2.HLA与人类学研究,HLA某些抗原的频率在不同民族和地区间有所差别 研究这些差别的分布和趋势，可以了解不同民族和地区人群的亲缘关系和迁徙情况 如我国南方人群的HLA-A11，B46高于北方人群，而HLA-A1却低高于北方人群，提示我国有两个主要群体,3.HLA与父权关系认定,细胞表面的HLA分子终身不变 HLA的遗传方式明确 如果可疑生父不具有子代的单倍型，即可排除其为生父的可能,A/B D/C,A/C,? ?,E/F,可能 排除,
