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1、微生物学实验 程国军 祝伟,课堂纪律,严格遵守实验室规章制度 严肃课堂纪律 不允许无故旷课、早退（1次） 迟到（3次） 不能做与实验无关的事,实验室安全和卫生,安全 实验室严禁吸烟。 注意用水、防电和防火 正确使用化学试剂和仪器,卫生 每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁,1、了解培养基的概念、种类和用途，明确培养基的配制原理。 2、学习掌握培养基配制的一般方法和步骤。 3、掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法步骤。,实验目的,一 培养基的配制,培养基(culture medium)是指人工配制的、适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和
2、研究目的不同，所以培养基的种类很多，不同种类的培养基一般都应含有微生物生长所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大营养要素，且各成分比例应合适。 为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基合适的pH。,实验原理,常用凝固剂是琼脂，固体培养基琼脂加量通常为1.5%-2%；半固体培养基琼脂加量为0.5%-0.8%。,实验原理 (continued),常用培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基广泛用于细菌的培养；高氏一号培养基用于培养放线菌；麦芽汁培养基和豆芽汁培养基通常用于酵母菌的培养；马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养霉菌。,实验分组安排,5-6人一组，配制牛肉膏蛋白胨固体培养基和
3、马丁氏固体培养基 每组 500ml 斜面2支（每人），余装三角瓶,牛肉膏蛋白胨培养基配方：,牛肉膏 1.5g 蛋白胨 5g NaCl 2.5g 琼脂 7.5-10g 水 500ml pH 7.4-7.6,1、称量及溶化,2、调pH,3、加琼脂、溶化、定容、（过滤）,4、分装（每人一只试管）、加塞、包扎,5、灭菌,6、摆斜面,操作步骤,称量与溶化：,注意： 1）牛肉膏的称取：用玻璃棒蘸取适量牛肉膏，抹于称量纸上，勿取过量，不足时，再蘸取少量，逐步添加；然后将牛肉膏连同称量纸放入水中，稍等片刻牛肉膏即从称量纸上脱落，用玻璃棒将纸捞出即可。,操作步骤 (continued),加琼脂、溶化、定容、（过
4、滤）, 琼脂一般应在调好了pH后加入，琼脂的加入不会影响培养基的pH。 琼脂加入后应煮沸数分钟，以使其完全溶化，否则易出现分布不均，导致部分斜面不凝固或过软，另外部分则琼脂过多。 加热过程中因水分蒸发而可能使培养基体积减小，应补充水分至所需量。,操作步骤 (continued),分装：,1）装量： 液体试管高度的1/4左右 固体试管高度的1/5 ，灭菌后摆斜面 半固体一般为试管高度的1/3，灭菌后垂直放置,操作步骤 (continued),分装：,2）分装装置：,操作步骤 (continued),3）注意： 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染；若不慎沾在了管口，
5、可用湿纱布揩净。,棉塞制作方法：,加塞： 棉塞 或 硅胶塞 作用：防止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。,包扎：,加塞后，试管通常每7支一起，包上一层牛皮纸或两层报纸，用线绳扎紧。三角瓶加塞后也用牛皮纸包扎。 以活结形式扎紧，以便使用时容易解开。 用记号笔注明培养基名称、配制日期、配制人或实验组。,操作步骤 (continued),灭菌时包牛皮纸,灭菌：, 培养基灭菌一般采用压力蒸汽灭菌 通常灭菌条件为1.05kg/cm2, 121.3灭菌20分钟；含糖量高的培养基，如马丁氏培养基则为0.56kg/cm2,112.6灭菌30分钟。 操作步骤详见下一课件,操作步骤 (con
6、tinued),摆斜面：, 成扎摆放，不需将每支试管单独摆放 最好待培养基冷至60时摆斜面，以免形成大量冷凝水,无菌检查：,将灭菌的培养基放在37温箱中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。,二 消毒与灭菌,加热法,干热法 湿热法,火焰烧灼 热空气灭菌,压力蒸汽灭菌 间歇灭菌 煮沸灭菌 巴斯德消毒,实验原理,1、了解掌握常用消毒、灭菌方法的原理。 2、学习掌握干热灭菌和压力蒸汽灭菌操作步骤。,实验目的,滤膜过滤器的滤膜是一种多孔纤维素，孔径一般为0.45um，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截流在滤膜上。,过滤除菌 许多材料，如血清、糖溶液等，用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，应采用
7、过滤除菌。 应用最广的过滤器有蔡氏(Seitz)过滤器和膜过滤器。,紫外线灭菌 紫外线波长在200-300 nm,具有杀菌作用，其中以265-266 nm杀菌力最强。 无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。,实验原理 (continued),干热灭菌,电烤箱,实验内容及实验步骤 1、干热灭菌 2、压力蒸汽灭菌,干热灭菌,1、装入待灭菌物品 2、升温 接通电源，加热升温至160-170。 3、恒温 保持160-170 2小时。 4、降温 切断电源，自然降温。 5、开箱取物 待烤箱温度降到70以下以后，方可打开箱门，取出物品。箱内温度高于70，切勿自行打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。,实验内容及实验步骤 (continued),实验内容及实验步骤 (continued),压力蒸汽灭菌,压力蒸汽灭菌,1、检查水位，放入物品。,2、加盖、拧紧 对称用力 3、加热升温 4、排冷空气 等压力升至0.5kg/cm2时，打开排气阀，排净冷空气。 5、升温、保压 等锅内压力升至所需数值（通常为1.03kg/cm2），保持压力20-30分钟。 6、降压、取物,实验内容及实验步骤 (continued),本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！ 请第一组同学留下值日 下周再见！,
