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1、动物细胞工程,动物细胞与组织培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,细胞核移植,动物细胞工程常用技术,体细胞克隆,（是其他动物细胞工程技术的基础）,动物细胞培养和核移植技术,问题：,2、许多动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞分泌的蛋白质的量是很少的，怎样才能获得大量的分泌蛋白呢？,必须借助于大规模的动物细胞培养,1、在治疗烧伤病人时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对一个大面积烧伤的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人的皮肤来源不足，而且会产生排异反应。那么。怎样才能获得大量的自体健康皮肤呢？,一、动物细胞培养的概念和应用：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相
2、关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,（1）动物细胞培养的概念：,（2）动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬液,胰蛋白酶或胶原蛋白酶,10代细胞,原代培养,50代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,接触抑制的细胞,胰蛋白酶,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官 和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,【思考讨论】： 在动物细胞培养过程中，为什么
3、要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？,胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,有关概念,原代培养：,传代培养：,从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代细胞培养。,贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。这样的培养过程通常被称为传代培养。,细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。,细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分
4、细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。,有关概念,细胞株：,细胞系：,细胞株和细胞系的区别：,讨论：,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题： 1、体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2、体外培养的细胞需要什么样的环境条件？,（3）动物细胞培养的条件：,1.无菌无毒的环境,2.营养,3.温度和pH,4.气体环境,1.无菌无毒的环境：,（1）对培养液和所有培养用具进行无菌处理。,（2）在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。,（3）应定期更换培养液，以便清楚代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成
5、危害。,2.营养：,（1）需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。,（2）将细胞所需的各种营养物质按其种类和所需数量严格配制而成为合成培养基。,（3）由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。,3.温度和PH：,细胞体外培养的适宜温度一般与动物的体温相近，哺乳动物多以36.50.50C为宜。多数细胞生存的适宜PH为7.2-7.4。,4.气体环境：,（1）细胞培养所需气体主要有O2和CO2。,（2）O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的PH。,（3）在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含
6、95%的空气和5%的CO2的混合气体的培养箱中进行培养。,（4）动物细胞培养技术的应用：,1、蛋白质生物制品的生产。,如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等,2、健康细胞培养。,4、用于细胞的生理、药理、病理研究,培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植,3、检测有毒物质的毒性。,培养正常细胞或各种病变的细胞，用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。,植物组织培养和动物细胞培养的比较,细胞的全能性,细胞的增殖,固体： 营养物质、激素,液体： 营养物质、动物血清等,培育成 完整植株,培育成细胞株或细胞系,获得细胞的产物或细胞等,快速繁殖，培育无病毒植株等,小结：,1、动物细胞培养液的主要成
7、分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,思考：,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素和动物血清等。,2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,3、为什么选用胰蛋白酶做上述处理？,因为动物细胞间隙中有弹性纤维等蛋白质和一些其它物质。,使每个细胞能与培养液接触,独特之处有： 1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,4、培养的细胞为何贴壁生长？,大多数组织细胞不适应悬浮生长，它们必须在固定的表面上生长和分裂。,5、动物细胞培养能否象植物组培那样最终培养成生物个体？,不能，,因为动物细胞的全能性受到抑制。,高度分化的植物组织仍保持着全能性，而动物细胞的全能性会随着动物细胞分化的
8、程度的提高逐渐受到抑制，分化潜能逐渐变弱。但其细胞核仍具全能性。,问题：,离体的植物组织或细胞在适当的培养条件下可发育成完整植株，那么，是否能用类似的方法，使动物的细胞发育成一个完整的个体呢？,不能；,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物:,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。,1、概念：,2、类型：,胚胎细胞核移植：,体细胞核移植：,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性较容易。,体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。,胚胎移植技术：,基本程序如下（以牛胚胎移植为例）,多莉羊的培育过程,3、体细胞核
9、移植技术：,4、体细胞核移植技术的应用前景：,（1）畜牧业：,利用体细胞克隆技术可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；,在保护濒危物种方面，可望利用体细胞核移植技术增加这些动物的存活数量。,在治疗人类疾病时，转基因克隆动物细胞、组织和器官可以作为异体移植的供体。,人的核移植胚胎干细胞经过诱导分化，形成相应的组织、器官后，可以用于组织器官的移植。,（2）医药卫生：,转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；,研究克隆动物和克隆细胞可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；,用克隆动物做疾病模型，能使人们更好的追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病。,5、体细胞核移植技术存在的问题：
10、,（1）体细胞核移植技术成功率非常低，产下的活克隆动物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%。克隆技术的各个环节也有待进一步改进。,（2）此外，一些人士指出，绝大多数克隆动物还存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷。,（3）对克隆动物食品的安全性问题也存在争议。,总之，体细胞核移植技术的研究还在继续深入，人类对克隆技术的应用还存在许多问题需要解决。期待在不远的将来，克隆技术能更好地造福人类。,动物细胞融合与单克隆抗体,专题2 细胞工程,一、动物细胞融合：,细胞融合是正常的生命活动。,两个细胞正在融合,受精作用,动物细胞融合：,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法 化学法,仙台病毒
11、疱疹病毒 新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞,一、动物细胞融合：,1、融合关键：,细胞膜的融合,2、融合手段：,物理法：,化学法：,生物法：,离心、振动、电激等,聚乙二醇（PEG）等诱导剂,灭活的病毒,3、融合原理：,4、融合过程：,膜融合,细胞膜的流动性,质融合,核融合,5、优势：,特别是为制备单克隆抗体开辟了新途径,6、应用：,突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。,问题：,1、什么是抗体？,抗体是机体受抗原刺激后产生的，并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,2、抗体是
12、怎样产生的？有何特性？,1、B淋巴细胞受抗原刺激后，可产生抗体。 、动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。 、每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,问题：,3、传统的方法如何得到抗体？它有什么特点？,传统的方法是采用把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体。,这种方法获得的抗体： 产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏。,4、如何解决这一难题？,制备单克隆抗体,二、单抗隆抗体：,1、概念：,用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（即克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体单克隆抗体。,单个 B淋巴细胞,细胞
13、群,单克隆抗体,无性繁殖（即克隆）,问题：,在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。那么怎样才能获得单克隆抗体呢？,单克隆抗体制备过程示意图,注射抗原,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,细胞培养,细胞融合、筛选,选出能产生特定抗体的细胞群，继续培养,单克隆抗体,(注射到小鼠腹腔内）,思考：,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理。,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。,3、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融
14、合？,4、骨髓瘤细胞是癌细胞吗？,细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越容易成活。,5、整个制备过程为何要经过两次筛选？,第一次筛选是得到杂交瘤细胞。,第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。,有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞；而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以，瘤细胞不能等于癌细胞。,6、杂交瘤细胞在小鼠腹腔内培养与在体外培养有何区别？,7、杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，可否造成小鼠死亡？,8、鼠单抗能用于人体疾病的治疗吗？,在小鼠腹腔内具有动物细胞培养所需的各种条件。,不能。,能。,3、单克隆抗体的应用：,与常规抗体相比
15、，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,目前世界各国已经研制出数以万计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,应用主要有：,1、作为诊断试剂：,由于单克隆抗体纯度高、特异性强，所以能准确地识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，因此，单克隆抗体在诊断的应用上，具有准确、高效、简易、快速的优点。,2、用于治疗疾病和运载药物。,（1）单克隆抗体主要用于癌症治疗，也有
16、少量用于其他疾病的治疗。,（2）如果把抗癌细胞的单克隆抗体跟放射性同位素、化学药物或细胞毒素相结合，制成“生物导弹”，注入体内，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量 。,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较：,细胞膜的流动性,去除细胞壁后诱导原生质体融合,使细胞分散后诱导细胞融合,离心、 电刺激、 振动、 聚乙二醇等,同上， 再加上灭活的病毒诱导,克服远缘杂交不亲和，获得杂交植株,制备单克隆抗体的技术之一,细胞膜的流动性,小结：,练 习,1、动物细胞工程技术的基础是（ ） A、动物细胞融合 B、胚胎移植 C、动物细胞培养
