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1、第十章 菌种退化与菌种保藏,第一节 菌种退化及防治 第二节 菌种保藏 第三节 菌种保藏机构,菌种是各个国家的重要自然资源，尤其是优良的工业生产菌种是有野生型菌种经过诱变育种、杂交育种、代谢工程等育种方法筛选得到的，其获得非常不容易，往往要花费很长的时间和大量的人力、物力。但微生物菌种在传代繁殖和保藏过程中会出现退化现象。所以，在科研和生产中应该设法减少菌种的退化和死亡。菌种保藏是一项重要的工业微生物学基础工作，其目的是保证菌种经过较长时间保藏后仍然保持较强的生活力，不被其他杂菌污染，且形态特征和生理性状尽可能不发生变异，以便今后长期使用。,第一节菌种的退化及防治 一、菌种退化 所谓菌种退化是指
2、生产菌种和优良菌种由于传代或保藏之后，群体中的某些生理特征或形态特征逐渐减退或消失，如生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失、典型性状变得不典型等。菌种退化是一个有量变到质变的逐渐的演化过程。开始时，在微生物群体中仅出现个别负变细胞，随着连续传代，负变细胞开始增加，最后在群体中占了优势，导致产量下降和优良性状丧失。 二、菌种退化的原因 1.基因突变是引起菌种退化的主要原因 微生物在移种传代过程中会发生自发突变，这些突变包括高产菌株的回复突变和新的负变菌株，它们都是低产菌株。开始时，这些突变菌株在群体所占的比例很小，但由于这些低产菌株的生长速率往往大于高产菌株，所以经过传代后，它们在群体中的数量
3、逐渐增多，直至占优势，表现为退化现象。,在育种过程中经常会出现初筛时产量很高，而复筛时产量又下降了的情况。这其实也是一种退化现象，气主要原因是由表型延迟造成的。一般突变都发生在DNA的单股链上的某个位点，经过DNA复制和细胞分裂后，一个细胞为突变细胞，另一个细胞为正常细胞。经过传代繁殖，正常细胞由于成长速率比高产菌株快，因此，在数量上占了优势，导致了产量的下降。 某些丝状菌的生活史中只有菌丝体不产生孢子，其菌丝为多核细胞，如果这些菌丝体在诱变过程中仅有一个核发生高产基因突变，那么，经过几代繁殖后将会出现分离现象，导致性状退化。 如果突变后产生的后代是非整倍体或部分二倍体，在繁殖过程中也会发生性
4、状分离，出现低产细胞，导致退化。 除了核基因突变外，某些控制产量的质粒脱落或核DNA与质粒DNA复制不一致（如质粒DNA的复制速度比核DNA低）也会导致菌种退化。,2.连续传代是加速菌种退化的直接原因 微生物自发突变都是通过繁殖传代发生的，移种代数越多，发生突变的概率就越高。另外，基因突变在开始仅发生在个别细胞，如果不传代，个别低产细胞不会影响群体的表型。只有通过传代繁殖后，低产细胞才能在数量上占优势，使群体表型发生变化，即导致菌种退化。 3.培养条件和保藏条件可以从多个方面影响菌种的性状 1）不同的环境条件可以诱发不同功能的基因显性 生物体的显性和隐性是相对的，它们可以随着环境条件的改变而变
5、化。一个优良菌株在不良的培养条件或保藏条件下，其高产性状也会变成隐性性状，即高产特征不会表现出来。,2）培养基的影响 培养基会影响不同类型细胞和细胞核的数量。这是由于不同培养基会影响群体细胞中高产突变细胞和低产野生型细胞是生长速度，从而使高产成本细胞和低产细胞的数量发生变化。对丝状微生物来说，不同的培养基也会使不同的类型的细胞核的数量发生变化。 培养基也会影响菌种的培养特征和形态特征。同一菌种在不同培养基上会出现不同的菌落形态，例如含高氨培养基不利于放线菌产生菌丝和孢子的形成。 3）培养条件的影响 除了培养基外，培养条件如温度、湿度、PH值、O2等也会影响菌种的退化，尤其是高温对菌种非常不利，
6、这可能与高温容易使某些酶失活和容易引起质粒脱落有关。 4）保藏条件 不良的保藏条件也会引起菌种退化。保藏条件要求绝氧、干燥、低温。,三、菌种退化的防治 遗传是相对的，变异是绝对的，所以菌种退化是不可避免的。因此，要求积极采取措施防止菌种退化。为了防止菌种退化，需要采取以下措施 1.尽量减少传代 连续传代是加速菌种退化的直接原因。因此要防止菌种退化，首先要减少传代次数。要尽量避免不必要的传代，并将必要的传代降低到最低限度。 2.用单核细胞和单菌落移种传代 放线菌和霉菌的菌丝细胞是多核的，其中也可能异核体或部分二倍体，所以，用菌丝接种、传代易产生分离现象，会导致菌种退化。因此，要用单核的孢子进行移
7、种，最好选用单菌落的孢子进行传代，因为单菌落是由单个孢子发育而形成的，其遗传特征一致，不会发生分离现象,3.经常进行菌种纯化 所谓菌种纯化就是对菌种进行自然分离。首先将菌种制成单细胞或单孢子悬浮液，经稀释后将其涂布与琼脂平板上培养，待平板上单菌落培养成熟后挑取单菌落移种斜面，再经摇瓶 试验后测定其生产能力，从中选出高水平的菌种。 4.采用良好的培养基和培养条件 培养基和培养条件可以从多方面影响菌种的性状，因此，为了防止菌种退化，要选择合适的培养基和培养条件。 5.采用科学的保藏方法 在菌种保藏过程中也会发生菌种退化现象，尤其是不良的保藏条件更易引起菌种退化。因此，要采取科学和有效的菌种保藏方法
8、以防止菌种优良性状的退化。,四、菌种复壮 菌种退化是不可避免的，如果生产菌种已经退化，那么我们要及时对已退化的菌种进行复壮，使优良性状得以恢复。从菌种退化的演化过程看，开始时所谓纯的菌株其实已包含了很少的衰退的细胞，到菌种退化时，虽然群体中大部分是衰退细胞，但仍有少数尚未衰退的细胞存在。因此，可以通过自然分离的方法将那些尚未衰退的细胞从群体中分离出来，使菌种的优良性状得以恢复。这就是所谓的菌种复壮。这种在菌种已退化的情况下通过自然分离的方法将少数尚未衰退的个体从退化的群体中分离出来以回复菌种原有优良性状的复壮，是一种消极的措施。积极的措施应该是在菌种的生产能力尚未退化前，经常进行自然分离，以保
9、持菌种的生产性能稳定，同时也有可能使菌种的生产性能得到进一步的改进或提高。,第二节 菌种保藏 菌种是一个企业乃至一个国家的重要生物资源，尤其是优良的工业生产菌种更是一个国家的重要财富，而科学的、有效的菌种保藏方法是防止菌种退化的必要措施，因此，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要意义。 菌种保藏要求不受杂菌污染，是退化和死亡降低到最低限度。从而保持纯种和优良性能。菌种保藏的基本原理是抑制杂菌的代谢活动，使菌种处于休眠状态、停止繁殖，以减少菌种的变异。为此，一个良好的保藏方法就要为菌种创造一个适合其长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺氧。缺乏营养、添加保护剂等。常用的菌种保藏方法有斜面保藏法。液
10、体石蜡保藏法、砂土保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥保藏法、低温保藏法、液氮超低温保藏法等。,一、斜面保藏法 斜面保藏法是将菌种接种于斜面培养基上培养，培养成熟后置于4冰箱保藏。斜面保藏法是一种短期的菌种保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌。 影响斜面保藏法的因素很多，归纳起来，主要有保藏培养基和保藏条件两个方面。保藏培养基一般要求营养成分相对贫乏些，氮资源略高而碳资源较低，以减少PH值下降。放线菌和霉菌以适当控制菌体生长而有利于孢子的形成为原则；采用贫乏和丰富培养基交替培养进行菌种保藏，有利于延缓菌种衰退。保藏条件要求温度控制在4左右；每13月移接一次；传代次数不超过34次。,斜面保
11、藏的缺点是斜面在保藏期间菌种的生长繁殖没有完全停止，存在自发突变的可能；在斜面转接过程中，易发生退化、污染；斜面在保藏期间，培养基中的水分易蒸发，导致渗透压增大，引起菌种衰退、死亡。 用斜面保藏发保藏菌种时，在斜面培养结束后，用无菌的橡皮塞代替棉塞，可以避免水分散发并且能隔氧，能适当延长菌种的保藏期。 二、液体石蜡保藏法 液体石蜡保藏法是直接将液体石蜡加入到生长好的菌种斜面上，然后将其放入4冰箱保藏，如图11-1所示。液体石蜡保藏法其实也是一种斜面保藏法，其优点是在斜面上加入了石蜡油，在保藏期间可以防止水分蒸发，并隔绝氧气，所以，能延长保藏的时间。液体石蜡保藏法的缺点是必须直立放在冰箱内，占据
12、较大的空间。,液体石蜡保藏法的应用较广，特别适用于固体培养基上不能形成孢子的丝状担子菌，但不适合以石蜡为碳源或对石蜡敏感的菌种 三、干燥保藏法 不少微生物能产生孢子或芽孢，孢子或芽孢处于休眠状态。在干燥环境中抵抗力强不会死亡。依据这一原理，可以把孢子或芽孢接种到适宜的载体上，人为地创造一个干燥的环境来保藏菌种。可以作为菌种干燥保藏的载体有砂土、滤纸、硅胶、麸皮等。干燥保藏法是将接有孢子或芽孢的载体经真空干燥置于低温下保藏。 1.砂土管保藏法 此法使微生物吸附在砂土上进行保藏，砂土保藏法包括制备砂土和埋砂土两个步骤,1）砂土制备 取黄沙，加入10%盐酸浸泡24h，倾去溶液，用自来水冲洗至中性，烘
13、干，60目过筛，再用磁铁除去黄沙中的铁质。另取未被污染的瘠薄的地表以下的土，用自来水浸泡冲洗至中性,烘干,碾细,过120目筛.将以上经过处理的砂和土以1:1或3:2的比例混合均匀,分装入小试管内,加上棉塞并包扎牛皮纸,与121间歇灭菌三次，每次灭菌时间为1h。,2）埋砂土 埋砂土的方法可以分为湿埋法、干埋法。湿埋法是取培养好的新鲜斜面，加入适量无菌水，轻轻刮下孢子，制成孢子悬浮液，再向每支砂土管中加入0.2mL孢子悬浮液，搅拌均匀，然后抽真空干燥4h左右，最后把制备好的砂土管放入干燥器内，置于冰箱低温保存。干埋法是直接从培养好的新鲜斜面上刮下孢子，加入到每支砂土管中，混匀，然后抽真空干燥42h
14、左右，把制备好的砂土管放入干燥器内，置于冰箱低温保存。 砂土管保藏法的优点是操作简便，使用方便，可反复多次使用，其缺点是微生物的新陈代谢没有完全停止，易引起菌种退化变异。砂土管保藏法适合于产分生孢子的霉菌、放线菌以及产芽孢的细菌，但不适于担子菌类、只靠菌丝繁殖的真菌、无芽孢的细菌、酵母等。,2.麸皮保藏法 将麸皮与水或其他培养基成分以一定的比例拌匀，水或培养液与麸皮的比例为1：（0.81.5），具体按照不同菌种对水分的要求不同而定。再将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中，并进行高温灭菌，装入的麸皮应保持疏松。然后将菌种的孢子液接入，混匀，并在适宜的温度下培养，直至长出菌丝。最后将培养好的试管
15、或安瓿管放在干燥器中干燥，干燥结束后置于冰箱冷藏室保藏。麸皮保藏法操作简单，菌种保藏时间长，不易退化，适合于产孢子的霉菌或放线菌。,四、冷冻干燥保藏法 冷冻干燥保藏法是将菌液在冻结状态下升华其水分，最后获得干燥的菌体样品。该法同时具备干燥、低温和缺氧的三个菌种保藏条件，具有变异少、保存时间长、输送和储存方便等优点，是目前菌种保藏的较好方法之一，该法应用范围广，适合于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母菌等，但不适合于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。 冷冻干燥保藏法的操作流程见图11-2。将安瓿管洗净，再用2%的盐酸浸泡10h左右，用自来水冲洗干净，烘干，塞上棉塞，灭菌后备用
16、。取培养成熟的新鲜斜面，加入适量已灭菌的脱脂牛奶，轻轻刮下菌体或孢子制成菌悬液，尽可能不带培养基。用灭菌过的长形滴管将菌悬液分装到安瓿管内，塞上棉塞，置于低温冰箱中预冻2h左右。,将安瓿管放入冷冻干燥机中抽真空4h左右。整个干燥过程，先是升华干燥，然后蒸发除去水分。干燥结束后，在真空下进行熔封（图11-3）。安瓿管密封后以高频电火花检查安瓿管的真空情况，管内呈灰蓝色逛表示已达真空。检查是电火花应射向安瓿的上半部，切勿直射样品。制成的安瓿管置于4冰箱或室温下保藏。,安瓿管 菌种 配制保护剂,酸洗、水洗 培养 分装,烘干 制备菌悬液 灭菌,灭菌 分装安瓿管,预冻,真空干燥,装在歧管上抽真空,火焰上熔封安瓿管口,检测真空 保藏 图11-2 冷冻干燥保藏法的操作流程,由于在冷冻干燥过程中和保藏期间细胞容易损伤和死亡，所以需要加入保护剂。通常用脱脂牛奶做保护剂，其制备方法如下：取新鲜牛奶，离心去除脂肪，再装入已灭
