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1、微生物生物技术及应用 张 松 Email： 华南师范大学生命科学学院 2010年6月,教材及参考书： (1)黄秀梨、辛明秀.微生物学，高等教育出版社，2009 (2)张 松.微生物学多媒体教学软件（网络版）.北京：高等教育出版社.2006. (3)黄文芳，张 松.微生物学实验指导.广州：暨南大学出版社.2003. (4)黄秀梨、辛明秀.微生物学实验指导.高等教育出版社，2008 . (5)张 松.食用菌学.广州：广州：华南理工大学出版社,2000。 (6)周德庆，微生物学教程，高等教育出版社，2002 (7)沈萍，微生物学，高等教育出版社，2006 (8)Lansing M. Prescott
2、, Microbiology 5th ed 影印版，高等教育出版社，2000 (9)Madigan M T et al.BrockBiology of Microorganism,10/e,Prentice Hall,2003,微生物与我们的生活,微生物类型 1、原核微生物：细菌、放线菌、衣原体 2、真核微生物：酵母菌、霉菌 3、非细胞型微生物：病毒、亚病毒因子 病毒,古代酿酒,酵母菌兼性厌氧微生物（有氧、无氧） 乙醇发酵： 酵母菌 C6H12O6- 2CH3CH2OH+2CO2+2ATP 果酒,果醋：醋酸菌：好氧（O2）,毛霉形态： 菌丝无隔膜 孢囊孢子 接合孢子,应用：酿造腐乳 1、前发酵
3、：毛霉的生长，15-20，菌膜形成； 毛霉（蛋白酶等） 蛋白质-氨基酸 2、后发酵：风味形成。,乳酸发酵 泡菜、酸奶,家居环境（菜板、抹布等）；,人体体表及体内（口腔、皮肤、肠道等） ：,微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。,土壤；,纸币（成都制造出抗菌人民币，2003）；,空气（每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万）；,微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！,时时刻刻与微生物“共舞” 是 祸？是 福？,物质循环；,微生物是人类的朋友！,体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；,有用物质的生产；,基因工程为代表的现代生物技术；,少数微生物也是人类
4、的敌人！,天花； 鼠疫； 艾滋病； 疯牛病； 埃博拉病毒； SARS； 禽流感；,“在近代科学中，对人类福利最大的一门科学， 要算是微生物学了。”,微生物生物技术,微生物学基本操作技术,基本操作技术1：培养基的制备,培养基 为人工培养微生物而制备、提供微生物以合适营养条件的基质。,培养基成分 微生物的生长需要有碳源、氮源、无机盐、生长因子等营养物质。 碳源为微生物营养提供所需的碳架和能源来源，主要有葡萄糖、淀粉、CO2等。 氮源为微生物提供所需氮素的营养来源，主要有蛋白胨、硝酸盐、铵盐、分子态氮等。 无机盐为微生物提供除碳、氮源以外的各种元素，主要有KH2PO4 、MgSO4、NaCl、CaC
5、l2等。 生长因子为微生物生长提供不可缺少的微量有机物质，主要有维生素等。,配制培养基的原则 1.根据不同微生物类型配制不同的培养基。 培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的培养基是不同的。 细菌 采用牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3 g; 蛋白胨 5 g; 水 1 000 mL; pH 7.27.4 放线菌 采用高氏1号培养基 可溶性淀粉 20 g; KNO3 1 g; K2HPO4 1 g; MgSO47H2O 0.5 g; NaCl 1 g; FeSO4H2O 0.01 g; 水 1 000 mL; pH 7.27.4 酵母和霉菌 采用察氏培养基 蔗糖 30 g; NaNO3 3 g; KCl
6、0.5 g; K2HPO4 1 g; FeSO4H2O 0.01 g; MgSO47H2O 0.5 g; 水 1 000 mL; pH 6.0 培养不同营养类型的微生物也各有不同的培养基。,2.注意各种营养物质的浓度与配比。 3.控制培养基的条件（pH、O2和CO2、螯合剂等）培养基。 pH 控制在一定的范围之内，通常在培养基里加一些缓冲剂，如K2HPO4、 KH2PO4等。 4.选择培养材料注意经济节约,价廉物美。,培养基的类型和应用 按培养基的成分 合成培养基: 顺序加入准确称量的高纯化学试剂与蒸馏水配制而成，组成成分精确，重复性强。 天然培养基: 采用动植物组织或微生物细胞或它们的提取物
7、或粗消化产物配制成的，其所用物质的成分不稳定，因而营养成分难控制，重复性差。 半合成培养基: 用纯化学试剂和天然物质配成。,按培养基的物理状态 固体培养基: 加了凝固剂后制成的呈固体状态的培养基。常见的凝固剂是琼脂(约2%)或明胶(5%12%)。 液体培养基: 呈液态的培养基。 半固体培养基: 液体培养基中加0.5%或更低浓度的琼脂就制成柔软的浆糊状半固体培养基。,按培养基的用途分为 加富培养基: 在普通培养基里加进血、血清、动物(或植物)组织液或其他营养物质(或生长因子)的一类营养丰富的培养基, 用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。 选择培养基: 根据某种或某一类群微生物的特殊营养需
8、要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的培养基，可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 鉴别培养基: 在培养基中添加某种营养物质或化学物质(指示剂或抑制剂)而将目的或对象微生物的菌落与同一平板上的其他微生物菌落区别开来的培养基。如伊红美蓝培养基(EMB培养基) 可鉴别肠道杆菌中的某些细菌。大肠杆菌在此培养基上形成有绿色金属闪光的深紫色菌落。其培养基成分为: 蛋白胨 10 g，伊红Y 0.4 g，乳糖 5 g，美蓝 0.065 g，蔗糖 5 g，K2HPO4 2 g，水 1 000 mL，pH 7.2,常用培养基配方 1、牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g
9、,琼脂20g, 水1 000mL，pH7.07.2。常用于培养细菌。 2、高氏1号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaC1 0.5g， K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂20g，水1 000mL，pH7.27.4。常用于培养放线菌。 3、察氏培养基：蔗糖30g，NaNO3 2，K2HPO4 1g，KC1 0.5MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂 20g，水1 000mL pH6.7。常用于培养霉菌。 4、马铃薯培养基（PDA） ：马铃薯200，蔗糖（或葡萄糖）20，琼脂20，水1 000m
10、L， pH 6.5（或自然）。常用于培养酵母菌、霉菌、食药用菌。,牛肉膏蛋白胨培养基制作流程： 计算用量称量溶解调pH过滤分装三角瓶包扎灭菌（ 121 0C, 30min）倒平板。,马铃薯葡萄糖培养基（PDA）制作流程： 马铃薯去皮、切粒煮8-10分钟后取汁使用加药品溶化琼脂溶化混合定容调节pH值分装灭菌倒平板。,高压蒸汽锅法是实验室及生产中最常用的灭菌方法。使用高压锅时，要注意完全排除锅内的冷空气，使之充满饱和蒸汽，否则会因蒸汽中混有空气而比相应纯蒸汽的温度降低，影响灭菌效果。,高压蒸汽锅的使用,基本操作技术2：无菌操作,无菌操作 为了防止其他微生物进入机体或物体造成污染，在制备培养基、使用
11、接种箱及无菌室、接种、分离和培养微生物时，都要进行无菌操作。 无菌操作技术主要有：培养基用高压蒸汽灭菌（0.1MPa，121，15-30min）；无菌室、接种箱、超净工作台等用紫外线灭菌（照射30min）；接种环、接种针用火焰灼烧灭菌；接种需在酒精灯火焰旁的无菌区进行，接种过程中的无菌操作。,高温灭菌方法,1、干热灭菌,（1)焚烧灭菌法（incineration）：用火焰焚烧。 （2)烘箱热空气法：常用烘箱160处理2小时以上。,2、湿热灭菌,（1)水煮沸法：水煮沸100，15分钟以上。 （2)高压蒸汽锅法（autoclaving）：高压锅（0.1013MPa或1.05/cm2 或15磅/英寸
12、2 ）121处理1530分钟 。 （3)间歇灭菌法(tyndallization) : 100处理15-30分钟，再置于2837下，如此反复三次。 （4)巴斯德消毒法（pasteurization)：71.6处理15分钟或62.9处理30分钟。,接种类型：斜面菌种；液体接种；穿刺接种,基本操作技术3： 微生物分离培养技术,微生物分离纯化 在自然界，各种微生物常常混生在一起。为了利用某种微生物，必须将这种微生物从混杂群体中分离出来，在适合的营养和生长条件下培养，产生大量的个体。,微生物的观察 微生物个体微小，其个体形态一般需用显微镜才能看到。 单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖，
13、会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落（colony）。 当固体培养基表面众多菌落连成一片时，则称为菌苔（lawn）。 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔在大小、形状、光泽度、颜色、质地、硬度、边缘情况、透明度等方面具有不同的特征，是微生物分类鉴定的重要依据。如细菌菌落具有湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀和颜色一致等特征，霉菌、放线菌等微生物的菌落也具有各自相应的特征。 在生产中，我们往往只需要某一种微生物，可采用涂布平板、平板划线等方法获得这种微生物的菌落。,用固体培养基分离方法： 1. 涂布平板法 2. 平板划线法 3. 稀释倒平板法,分离纯化
14、操作步骤： 1.用涂布平板法从土壤中分离细菌：制土壤菌悬液涂布分离倒置培养 2.用平板划线法从腐烂水果中分离酵母和霉菌,细菌菌落的分离要使用平板，而不采用斜面。 涂布平板分离法和平板划线分离法为什么能分离出细菌的单菌落？ 如果进行分区平行划线，细菌单个菌落最可能出现在哪一个区？如果进行连续画线，细菌单个菌落最可能出现在什么区域？ 在平板划线分离操作中，每次划平行线前都必须烧掉接种环的剩余物。 平板倒置培养。,微生物分离培养技术活动拓展 学习了细菌菌落的分离和培养后，请设计实验方案，从自然环境分离并培养与人类生活关系密切的其它微生物（如酵母菌、霉菌等）菌落。 （可根据生活环境寻找特定的微生物。酵
15、母菌喜欢生活在含糖高的环境，霉菌多生长在偏酸的环境，如水果、蔬菜的表面及其栽培土壤中。 ）,基本操作技术4：培养基对微生物的选择作用,培养基对微生物的选择作用 如果我们所需的微生物在样品中的数量很少，直接采用涂布平板法、平板划线法就很难分离出来。为此，我们可以根据不同的微生物对营养物质（碳源、氮源、生长因子等）、理化因素的不同要求，设计出不同的培养基以抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。例如，要从土壤中分离获得自生固氮菌时，常采用无氮源的培养基进行培养，可以抑制其他非固氮微生物的生长，从而将自生固氮菌分离出来。,利用培养基选择培养所需的微生物 在自然界混杂的微生物群体中，如果所需的
16、某种微生物只占少数，但其生长要求是已知的，那就可制作一种特别适合于这种微生物生长的培养基，从而把它选择培养出来。,选择培养方法主要有： （1）采用加富培养基进行选择。加富培养基就是在培养基中加入所需微生物特别需要的某一营养物质，使它们的数量增加，以达到选择目的而设计的培养基。自然界中数量较少的微生物采用这种方法，可使该微生物大大增殖，在数量上超过原有占优势的微生物，以达到加富培养的目的。用于加富的营养物质通常是所需微生物专门需要的碳源或氮源。例如，筛选纤维素分解菌可用纤维素，加富酵母菌可用较浓的糖液。,（2）用化学物质进行选择。不同的微生物对某种化学物质或者理化因素的反应不同，依此设计培养基并经培养后，所需微生物可大大增殖，使之在数量上占优势，而其他微生物的生长受到抑制，从而达到选择培养的目的。 化学物质常有染料（ 结晶紫等）、 抗生素
