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1、第一章 绪论,1. 酶工程地位,2. 酶是什么？,酶（enzyme)是具有催化反应功能的蛋白质。 19世纪中叶，巴斯德认为活的酵母细胞内有一种可以将糖发酵为乙醇的物质。 1878年，Kunne将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。希腊文的意思是“在酵母中” 1926年，Sumner首次从刀豆提取液中得到尿酶结晶，并证明其为蛋白质。 核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子,是生物催化剂。 1982年，Cech在四膜虫中发现核酶。,酶的发展史,4000多年前，酿酒，不自觉利用酶的时代 1833年第一次分离到酶，淀粉酶 19世纪中叶，Pasteur提出活酵母内存在一种将糖转化为乙醇的物质，1
2、878，Kunne首次将其称为酶（Enzyme，源于希腊文，意思是在酵母中） 1913，米氏方程 1926年，Sumner首次从刀豆中纯化得到脲酶结晶，并证明其为蛋白质。获得1947年的诺贝尔奖。 1950s，Koshland提出诱导契合学说，解释了酶的转移性。 1969年，Jacob和Monod提出操纵子学说，阐明酶生物合成的调控机制。 1982年，Cech发现四膜虫的核酶Ribozyme。获得1989年诺贝尔奖。 1980s，非水相催化,3. 酶学理论研究,脲酶结晶的获得与蛋白质本质 锁匙学说与诱导契合学说 中间络合物学说与酶促反应动力学 酶作用机理（酶理化性质及催化性质）的研究 酶蛋白质
3、一级结构测定方法 酶蛋白分子结构与功能的关系 酶学是生物化学的重要分支,4. 酶工程应用研究,1、酶制剂的分离、提纯、大批量生产及新酶的开发； 2、酶生产中的基因工程技术的应用； 3、酶分子的改造(修饰、模拟与抗体酶等）； 4、酶与细胞的固定化； 5、酶制剂的应用性开发； 6、生物催化； 7、酶抑制剂、激活剂开发及应用研究； 8、酶反应器的研究（包括反应检测、酶传感器）； 酶工程（Enzyme Engineering）是生物工程的主要内容之一，是随着酶学研究迅速发展、特别是酶的应用推广，使酶学和工程学相互渗透结合，发展而成的一门新的技术科学。,5. 酶的重要性,生命离不开酶； 酶是现代生命科学
4、的重要工具； 生物催化改造传统产业工业生物技术 已发现生物体内的酶接近10000种，数百种得到结晶。 X-Ray，Maldi-TOF成为现代重要研究工具,6. 酶催化作用的特点,酶催化作用的专一性强 酶催化作用的效率高 酶催化作用的条件温和,7. 酶的分类和命名,氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 合成酶,8. 米氏方程,Michaelis & Menten根据中间产物学说推 导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度 关系的公式称为 米氏方程：,米氏方程的推导： 根据中间产物学说：,式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知： ES形成速度= K1 E S ES分解速度=(K2, + K3
5、 ) ES 当反应达恒稳态时,二速度相等,即: K1 E S =(K2, + K3 ) ES,K1,K3,K2,整理并令： 由于E 与ES之和为总的酶浓度E0 , 即: E0= E +ES E = E0ES 将代入:,(E0ES),S,Km,整理得: 酶促反应速度由ES决定,而v= K3 ES ES= 将代入整理得:,此时达到最大反应速度Vmax: Vmax= K3 E0 将代入 即为米氏方程,当S 升高,所有E为S所饱和时,即: E0 =ES,Vmax,关于米氏方程的讨论,1、 Km S 时： v=VS/ Km 初速度与S成正比的一级反应。 2、若Km S时： v=V 零级反应 3、若Km
6、= S时： v=1/2V,酶反应速度与S的关系,米氏常数Km的意义,1、概念： 反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 2、单位： mol/L 或 mmol/L 3、意义： Km是酶的特征性物理常数。 只与E性质有关，与E无关； 如：某一底物有几种酶，各有一定的Km值。 测Km可鉴别酶。, 同一E, 有几个S 就有几个Km， Km最小的为最适S或天然S。 Km大，E 与S亲和力弱； Km小， E与S 亲和力强。 4、实际用途： 1）可由所要求的 V 求S； 例：求反应速度达最大反应速度99%时 的至少底物浓度 2）根据已知S求该反应V。,求米氏常数的方法,将米氏方程两侧取倒数， 以1/v 对
7、1/S作图 得Lineweaver-Burk方程：,Lineweaver-Burk作图法 （双倒数作图法）,Km求法: 1、量横截距； 2、量纵截距结合斜率,9. 酶分析 （Enzyme Assay）,以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性； 如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定； 葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活 力测定等；,酶分析 (即酶活力测定) （Enzyme Assay）,酶活力：是指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表示。（单位时间底物减少或产物增加） 一个酶单位（active unit, U，I.U）为
8、在确定的最适反应条件下，每分钟催化1mol(微摩尔）底物变化所需要的酶量。（国际酶委员会规定） 所以：酶的单位数与速度值数值上相等,（一）、测定原理： 测酶活力就是在确定的最适反应条件下测定酶促反应速度， 酶促反应速度取决于那些因素 ？ 速度方程,如何测反应速度？ 根据米氏方程：,V= = = ,Vm s,Km+s,K3E0s,Km + s,K3 s,Km + s,E0,关键是如何使反应速度取决于E0 ? 控制一定条件、固定底物浓度，则以此测得的酶反应速度可用来定义酶浓度。,如何使酶促反应速度仅仅取决于酶量？ 当S100Km时：v= Vm S / (Km +S)Vm，即反应初速度接近于最大速度
9、。而Vm = K3 E0，即酶活性直接正比于E0 ，而与S无关（表明酶活性部位全部被底物占据）。在测定酶活性时，一般选择此条件。,v,S,S或P,S0,S,P,S0/2,t1/2=S0/2Vm,t,测定酶活力的基本要求： 1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）； 2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）； 所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面做工作： 底物？ pH？ 温度？ 样品？,（二）、测定条件选择： 1、底物 种类选择：最适底物，如- a）对于绝对专一的酶无可选择；若相对专一则选Km最小的底物，即所谓最适底物；一般选工作底
10、物（胰凝乳蛋白酶对肽键、酯键、酰胺键）； b）要求反应前后有可测定的理化性质变化，如： 脱氢酶的NAD+、溶菌酶 c）稳定,浓度选择： a） s=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。,2、最适pH a）选择最适pH并维持在这一范围。 b）pH的稳定通常借助缓冲系统来控制，要 求稳定、无干扰、价廉。 C）离子种类和强度。 如：柠檬酸、磷酸系统等。可查表选取。,3、 最适温度 酶反应温度系数为每变化 1 摄氏度，反应速度相差10%以上。所以测酶活力时温度保持恒定十分重要，一般应控制在正负1摄氏度以内。,4、样
11、品,对某一待测样品测定前,除了上述因素需考虑外，还有一个重要问题是对样品的了解，要确定样品中有无干扰测定结果的因素（与待测酶作用同一底物或生成同一产物的其它酶）。,空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自发反应）引起的变化量 空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预先使酶失效而测定 例如： GPT 测定中 先不加底物； 酸性磷酸酯酶中 先不加酶； 对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样品酶对照来定量。,（三）、测定方法（测产物增加量）, 取样测定法 在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，并用适当方法停止其反应后（酸、碱、热；变性剂等），再根据产物与底物在物化性质上的差
12、别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量的方法； 连续测定法 根据底物产物的理化性质不同，在反应过程中对系统进行直接、连续观察的方法。, 化学法: 是取样法的一种,比较古老,但目前仍普遍使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学性质找出具体的有特异性的测定方法。 例：腈水合酶丙烯酰胺测定 （工作量大、含误差大、不够准确）, 光学法（灵敏度高、快速、简便） 它是一种连续测定法，是根据底物和产物在某一波长或波段上有明显特征吸收差别而建立起来的方法。 光学法又可分为三种： 光吸收法； 荧光法； 旋光测定法。,光吸收法： 这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。 1
13、、脱氢酶的辅酶NADH(NADPH)在340nm有吸收峰的特征； 2、双键的变化常伴随光吸收的变化，所以催化双键饱和或双键形成的酶反应，也可用光吸收法； 3、催化环状结构变化的酶反应也常用此法测定。 许多酶本身不能采用光吸收法，但其产物中有脱氢酶底物，则因此可用酶偶联进行测定。,荧光法： 其原理是酶反应的底物或产物具有荧光性，用荧光变化速度即可测出反应速度。荧光法的灵敏度比光吸收法高2-3个数量级，特别适于酶或底物量低的分析。但荧光法干扰多，需要校正。, 旋光测定法： 某些酶反应过程中常伴随有底物或产物旋光性质变化。可用自动旋光仪来测定这类酶的反应。此法准确度、灵敏度不高，不方便，但在没有其它
14、更好的方法时，可考虑采用此法。 如在蔗糖酶催化蔗糖转化为葡萄糖或果糖的反应中，可采用旋光测定法。, 电化学法: 也是一类连续测定法，其灵敏度和准确度都很高，可和光学法相比；而且测定系统被污染也不会影响结果，主要用电极进行测定，常用的是离子选择性电极和氧电极。, 量气法: 主要用于有气体吸收或释放的反应，如氧化酶反应耗气、脱羧酶、脲酶等催化的产气反应。常用瓦氏呼吸仪测定恒定体积内压力变化。此法主要缺点是准确度、灵敏度不太高，且操作麻烦。, 放射化学测定法: 测定时用同位素标记底物，在酶反应进行中，导致放射性标记产物定量形成，分离产物与底物，进行产物的放射性测定或未反应底物的放射性测定，这样就可测
15、知反应进行的速度或酶的活性。 用于标记的同位素通常有： 3H、14C、32P、35S、131I, 酶偶联分析法: 某些酶本身不能应用上述几种方法测定时，则可偶联一个酶反应进行测定。所谓酶偶联法是应用过量、高度专一的“偶联工具酶”使被测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。,A B C,E1,E2,A B C,E1,E2,被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过NADH的特征变化而测知。,G + ATP G-6-P + ADP,HK,被测反应：,偶联指示反应：,G-6-P + NADP NADPH + 6-PGCOOH （关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v是总反 应系统中的限速因子，测得的指示反应速度 和E1浓度间呈线性关系）,G6PDH,（四）、测定：,1） 测产物生成速度 酶活力大小可用反应速度表示，反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示：,V = = ,dS,dt,dP,dt,
