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1、第 七 章 微生物的遗传变异 和育种,目的与要求： 本章主要使学生了解微生物遗传因子的构成、理解其中的概念、术语，掌握基因突变的特点、重要类型，诱变育种的操作过程，理解并掌握原核、真核生物基因重组和杂交育种的原理及方法。 重点、难点 （1）基因突变的特点及重要类型 （2）证明基因突变自发性和不对称性的的原理 （3）诱变育种的原理、方法及操作过程 （4）基因重组及杂交育种的类型、原理,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：,表型：,生物的全部遗传因子所携带的遗传信息,具有一定
2、遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,表型饰变：,表型的差异只与环境有关 特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture grown at 25C, slant cultur
3、e grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,微生物是遗传学研究中的明星？,第一节 遗传变异的物质基础,一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验 （一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith （二）噬菌体感染实验：A. D. Hershey和M. Chase （三）植物病毒的重建实验：H. Fraenkel-Conrat,（1）动物实验,混合培养,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,Griffi
4、th转化试验示意,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,热死SIII菌不生长 活 RII 菌长出RII菌 热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2
5、）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,（三）植物病毒的重建实验,因此:,只有核酸（DNA、RNA）才是负载遗传信息的真正物质基础。,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 细胞水平：存在于细胞核或核区 细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，(核仁、固定形态、与组蛋白结合） 核外DNA 染色体水平: 不同生物染色体数p193 染色体倍数：同一细胞中相同染色体的套数 核酸水平 ：DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链,基因水平： 基因： 生物体内，一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，它的物质基础是一个具特定核苷酸顺序的核酸片段， 大小为1000-
6、1500bp 功能：表达和产生基因产物 原核生物基因的表达通过组成操纵子形式： 命名,原核生物的基因结构的特点： 1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）； 2）基因组上遗传信息具有连续性； 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短；,真核微生物（啤酒酵母）的基因结构的特点： 1）基因的非连续性 2）没有明显的操纵子结构 3）转录和转译有空间间隔 4）重复序列多,密码子水平： 遗传密码： 指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。 密码子：信息单位 核苷酸水平： 最低突变或交换单位，四种核苷酸,核外DNA的种类,
7、核外染色体,真核生物的“质粒” 原核生物的质粒,线粒体 细胞质基因 叶绿体 （质体） 卡巴颗粒 酵母菌的2m质粒,F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒 巨大质粒 降解性质粒,三、原核生物的质粒,质粒（plasmid）： 独立于核基因组外，能自主复制的小型共价闭合环状的双链DNA分子,（一 ）质粒的分子构型 通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称ccc)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞质中； 也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒,（二） 典型质粒,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,F质粒（Fertility plasmid ，F因子） R质粒（Resis
8、tance plasmid ，R因子） Col质粒（ colicin plasmid） Ti质粒（tumor inducing plasmid） Ri质粒（ root inducing plasmid) 巨大质粒 降解性质粒,P199-201,(三)质粒的主要生物学性质 1、质粒的自我复制 2、质粒的存在形式：独立存在、附加体 3、质粒携带的基因 4、质粒的亲和性和不亲和性 5、有的质粒具有转移性 6、拷贝数 严紧型质粒和松弛型质粒,三、质粒在基因工程中的应用 质粒在基因工程操作中的优点 ： 1.体积小，便于DNA的分离和操作； 2.呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性； 3.有不受核基因组控
9、制的独立复制起始点； 4.拷贝数多，使外源DNA可快速扩增； 5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。,E.Coli 的PBR322质粒,第二节 基因突变和诱变育种,基因突变(gene mutation) 指细胞(或毒粒)内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。 突变的原因：自发突变、诱变,基因突变,狭义：点突变 广义：基因突变和染色体畸变,突变株（mutant）： 野生型（wild type）：,一、基因突变的类型 按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分： 选择性突变株（selective mutant）： 1.营养缺陷型 （auxotroph） 2.抗
10、性突变型 3.条件致死突变型 非选择性突变株（non-selective mutant）： 4.形态突变型 5.抗原突变型 6.产量突变型,（二）突变率 定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数,（三）基因突变的特点 1、自发性： 2、不对应性： 3、稀有性： 4、独立性： 5、可诱变性： 6、稳定性： 7、可逆性：,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明 1. 变量试验fluctuation test 2.涂布试验 3. 平板影印培养试验（replica
11、plating）,变量试验又称波动试验或彷徨试验。 1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理，设计了左方的实验。,1. 变量试验fluctuation test,2.Newcombe涂布试验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,3. 平板影印培养试验（replica plating）,1952年，J. Lederberg夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变株的间接选择,平板影印培养法,（五 ）基因突变的机制,基因突变的具体类型可归纳如下：,1、诱变机制,诱发突变： 利用物理、化学、生物的因素，提高突变率的人为的作法 诱变剂（mutagen）：凡能
12、提高突变率的任何理化生物因子,（1）碱基置换（substitution）,定义：属于一种染色体的微小损伤（microlesion它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。 分类：转换（transition） 颠换（transversion,直接引起置换的诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。 种类： 亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。 作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。
13、,这类诱变剂主要是一些碱基类似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等； 作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。,间接引起置换的诱变剂,（2）移码突变 frame-shift mutation,指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该基因该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。 吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和-氨基吖啶等，以及一系列称为ICR类的化合物,吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：,（3）染
14、色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，它包括： 染色体结构上的变化： 缺失（deletion） 重复（duplication） 易位（translocation） 倒位（inversion） 染色体数目的变化,转座（transposition）,转座： DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体的某一部位转移到同一染色体的不同部位或不同的染色体上某一部位的现象 专座因子： 具有转座作用的这段DNA序列，也称作跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（movable gene） 转座因子的种类：
15、插入序列（IS，insertion sequence）： 转座子（Tn，transposon） Mu噬菌体（即 mutator phage）,转座因子特点： 非同源重组的方式转移到染色体的新部位 两端各有一段末端重复序列 具有转座酶基因,2、 自发突变：无人为因素下的低频率突变 其原因： （1）背景辐射和环境因素引起 （2）有害产物积累 （3）碱基错配,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,1、光复活作用,2、切除修复,（一）自发突变与育种 1、从生产中育种 如：抗噬菌体感染，“上酒白种” 2、定向培育优良菌株（“驯化”） 如：炭疽活菌疫苗，卡介苗 （二）诱变育种 诱变育
16、种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,二、突变与育种,1、 诱变育种的基本原理和环节：,2、诱变育种的一般步骤,出发菌株 纯化、活化、同步培养 培养液 离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤） 单细胞或单孢子悬液 活菌计数，诱变预备试验 诱变处理 活细胞计数，致死率计算 中间培养(后培养) 平板分离 变异率计算 初筛复筛 保藏及扩大试验,1）选择简便有效的诱变剂 2）挑选优良的出发菌株（original strain） 3）处理单细胞或单孢子悬液 4）选用最适的诱变剂量 5）充分利用复合处理的协同效应（synergism） 6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 7）设计高效筛选方案（筛选比诱变更重要） 8）创造新型筛选方法,3、诱变育种中的几个原则,诱变育种的主要环节： 诱变和筛选 （1
