微生物制药工艺技术基础课件

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1、第一节 菌种选育,生 物 制 药 工 艺 学,第三章 微生物制药技术工艺基础,一、 微生物的遗传和变异,遗传保持物种的相对稳定性 变异促使新性状的产生、获得新的优良品种 遗传型变异：在遗传物质水平上发生了改变，从而引 起某些相应性状发生改变的特性 变异性 表型变异：微生物在生活条件发生改变时，发生暂时 的形态、生理等特性的改变，但随着环境 条件的复原，它们又恢复了原有的特性,（一） 基因突变 基因突变是指遗传物质（DNA或RNA）中的核苷酸顺序发生了稳定的可遗传的变化，主要包括点突变和染色体畸变两大类。 1、点突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变引起的。 2、染色体畸变是指DNA大

2、段变化（损伤）的现象，主要包括染色体结构上的变化和染色体数目的变化。 （二） 基因重组 指两个或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，经重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体。,二、菌种选育的经典方法,1、自然选育 是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。 特点： （1）能纯化、复壮菌种，稳定生产 ，提高平均生产水平。 （2）难以选育高产突变菌株，不能使生产水平大幅度提高。,2、诱变育种 诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子中，促使生物体发生突变，进而

3、从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。 特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的几率。,物理诱变剂：紫外线、x射线、Y射线、快中 子、射线、超声波、激光 诱变剂 化学诱变剂：氮芥、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、 甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、 亚硝基甲基脲、亚硝酸 生物诱变剂：噬菌体,三、现代菌种选育技术,1、 杂交育种： 指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。 优点：能集中位于不同品种中的优良性状。 缺点：只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因。杂交进程缓慢，过程繁琐。,2

4、、 原生质体融合 用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用融合剂（如聚乙二醇）促进原生质体发生融合，从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。 细胞（A+B） 细胞（AB+） 脱壁处理 脱壁处理 原生质体（A+B） 原生质体（AB+） 混合 加融合剂 原生质体融合 涂平板（原生质体再生） 形成菌落 检出重组子菌落（A+B+）,3、 基因工程（基因拼接技术或DNA重组技术） 是指按照人的意志，将某一生物体(供体)的遗传信息在体外经人工与载体相接(重组)，构成重组DNA分子，然后转入另一生物体(受体)细胞中，使被引进的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。 研究和开发的趋势有： 1.基因

5、克隆产生杂合抗生素。 （一旦取得了抗生素的结构基因，将基因片段送入特定性质的另一种抗生素产生菌中，即可能产生完全符合人们设计的新抗生素。） 2.基因重组获得新抗生素 。 （通过两种基因型不同的菌株结合，使遗传物质重新组合，从中筛选具有新性状的菌株，其中可能有原抗生素高产株，也可能有产生新抗生素的子株。）,第二节 菌种保藏,定义： 将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。 条件及原理 ： 1. 低营养 2. 干 燥 3. 隔 氧 4. 低 温,降低代谢速率或使细胞处于休眠状态,一、定期移植保藏法 （斜面低温保藏法 ）,1原理 制造低温环境，降低菌

6、种的新陈代谢活动能力。 2、方法 将菌种接种于所要求的培养基上、置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在4左右，湿度小于70的条件下保藏每间隔一定时间重新移植培养1次。,3、特点 （1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期 保藏，一般可保存16个月左右。 （2）优点：简便易行，容易推广，存活率高； 缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能 力，保藏期短，传代次数多，菌种 较容易发生变异和被污染。,二、石蜡油封藏法,1、原理 用液体石蜡防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长保存时间。 2、方法 在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养

7、成熟的菌种斜面上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内保藏。,3、特点 （1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏，一般可保存12年左右。石蜡油管的转接和搬运不方便。 （2）不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。,三、砂土管保藏法,1、原理 低温、干燥、隔氧和无营养物 2、方法 将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121蒸汽灭菌11.5h，间歇灭菌3次。50烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约24

8、h，用火焰熔封管口（或用石蜡封口），置于干燥器中，在室温或4冰箱内保藏。,3、特点 （1）适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。 （2）保藏期较长，约110年。效果较好，且微生物移接方便，经济简便。,四、麸皮保藏法,1、原理 以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。 2、方法 将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。,3、特点 （1）此法适用于产孢子的

9、霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。 （2）操作简单、经济实惠，工厂较多采用。,五、冷冻真空干燥保藏法（冻干法）,1、原理 在较低的温度下（一15以下），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。经过冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因此菌种可以保存很长时间。 2、方法 将准备保存的新鲜斜面菌种，在无菌条件下，装入灭菌的保护剂（常用脱脂牛奶和血清），制成菌悬液，再用无菌带橡皮头的滴管将菌悬液分装到准备好的安瓿管中，-35下预冻15min一2h，然后进行真空于燥，最后将安瓿管真空熔封，低温避光保存。,3、特点 （1）此法适用于各大类微生物。 （2

10、）此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达515年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。 （3）该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。,六、液氮超低温保藏法,1、原理 微生物在130的低温下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。 2、方法 取合适的培养物，以510的甘油或二甲亚砜制成孢子悬液或菌悬液。将此悬液注入无菌的安瓿管或聚丙烯小管内，密封，在液氮超低温（196）下保藏。,3、特点 （1）适用于各种微生物菌种的保藏。 （2）保藏期一般可达到15年以

11、上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。 （3）优点：操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。 缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。,第三节 培养基,一、培养基组成与成分 人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖和积累代谢产物的营养基质。 碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长因素、前体、诱导剂或刺激剂、抑制剂 例：高氏培养基（培养放线菌）： 可溶性淀粉 2克，硝酸钾 0.1克，磷酸氢二钾 0.05克，氯化钠 0.05克，硫酸镁 0.05克，硫酸亚铁 0.001克，琼脂 2克 ，水 100毫升。,（一）碳源：,提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗生素

12、的碳骨架。 1碳水化合物：单糖，多糖，多聚糖（蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等） 2脂肪 ：油（脂肪）水解脂肪酶 甘油（脂肪酸）溶解氧 C02+H20,3有机酸 有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。 注意！有机酸的利用常会使pH上升。 CH3COONa+O22CO2+H2O+NaOH,（二） 氮源：,主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。 1、无机氮源（快速利用N源）：铵盐（如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝酸钾）和氨水等。 特点：（1）分解快，能被微生物迅速利用； （2）引起pH变化。 (NH4)2S04 2NH3+H2S

13、04 生理酸性物质 NaNO3+4H2NH3+2H20+NaOH 生理碱性物质,2、有机氮源（慢速利用氮源） ：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。 在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢最终用于合成菌体细胞物质和含氮的目的产物。,（三） 无机盐、微量元素：,微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物质的组成或代谢的调节物。 P、S（可构成细胞物质） Mg、Fe（可作为酶的组成成分或维持酶活性） K、Na（调节细胞渗透压） Cu、Zn、Mn（作为酶的辅基和激活剂）,（四） 水：,（1）构成生物体的成分；

14、（2）培养基的组成部分； （3）参与代谢反应； （4）作为代谢反应介质； （5）作为物质传递介质； （6）良好的热导体。,（五） 生长因素 ：,生长因素：有些微生物即使在具有合适的水分、碳源、氮源、无机盐等的条件下，还不能生长或生长不好，但如果加入少量微生物生长所必需的有机物质，则生长良好。通常把这些特殊的营养物质称为生长因素。 1 维生素：是辅酶的组成成分； 2 氨基酸：有些生物不能合成某种氨基酸； 3 嘌呤和嘧啶：构成核酸和辅酶。,（六） 前体,在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分，而化合物本身的结构设没有大的变化，这些物质称为抗生素的前体。,

15、（七） 诱导物或刺激剂：,所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成能力的小分子物质。 如：吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂。,（八） 抑制剂 ：,在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某一代谢途径，就会使另一代谢途径活跃。 如加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，从而增加利福霉素B的含量和产量。,二、 培养基的种类,（一） 按来源分类： 1、合成培养基 （1）所用原料的化学成分明确、稳定； （2）实验重现性好、低泡； （3）适用于研究菌种基本代谢和过程的物质变化； （4）营养单一，价格昂贵，不适用于大规模工业生产。,2、天然培养基（天然的

16、动植物产品 ） （1）营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。 （2）组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，适用于工业生产。 （3）组分复杂，不易重复，若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。,（二） 按状态分类：,固体培养基 ：适用于菌种的分离和保存； 半固体培养基 ：（琼脂用量为0.50.8） 主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及 噬菌体的效价测定等 ； 液体培养基 ：（水8090），是发酵工 业大规模使用的培养基，它有利于氧和物 质的传递。,（三） 按用途分类：,1孢子培养基 供菌种繁殖孢子的固体培养基。 能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引起菌种发生变异。 例如：高氏培养基,2种子培养基 指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。 主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮和使各种有