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1、微生物知识,&环境控制要求,孙青 2014.10.21,第一部分 微生物知识,什么是微生物？,定义：微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。 必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。,微生物的分类,具有细胞结 构的微生物,没有细胞结构的 微生物：病毒,原核生物 （由原核细胞构成的）,真核生物 （由真核细胞构成的）,真菌 显微藻类 原生动物,细菌,放线菌,细菌：肺炎球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌 真菌：蘑菇、霉菌、酵母菌、念珠菌（湿疹） 放线菌：从放线菌中发现链霉素、土霉素 支原体：肺炎支原体 衣原体：沙眼 立克次体：斑疹伤寒 螺旋体：梅毒 病毒：甲
2、、乙肝病毒，麻疹病毒，流感病毒。,微生物种类八大类,细菌：是一类细胞细而短、直径一般为0.55.0m， 结构简单、细胞壁坚韧，以二分裂方式无性繁殖的原核微生 物，分布广泛。生长最适温度为3035，主要去除方法有 紫外杀菌法、滤膜过滤法及高温杀灭法等。 个别细菌如：嗜热脂肪芽孢杆菌，能在121条件，可耐受 45min。,灭菌柜验证中作为生物指示剂 最适合生长条件为5560,微生物种类,真菌：包括单细胞与多细胞两类，单细胞真菌呈圆形 或卵圆形称为酵母菌；多细胞真菌由菌丝和孢子组成，称为 丝状菌或霉菌。 真菌生长的最适的温度为2328，一般加热6070 1小时即被杀死，用一定浓度的酒精及甲醛也可杀死
3、。 病毒：属非细胞型微生物，在自然界分布非常广泛， 可在人、动物、植物、真菌和细菌中寄居并引起感染。病毒 是体积最小、结构最简单的微生物，它仅有一种核酸（DNA 或RNA）作其遗传物质。,微生物种类,微生物,体积小、面积大,适应强、变异频,生长旺、繁殖快,吸收多、转化快,分布广、种类多,微生物五大共性,个体极其微小，必须借助显微镜放大几倍、几百倍、上千倍，乃至数万倍才能看清。,食谱广泛，凡是动植物能利用的营养，微生物都能利用，大量的动植物不能利用的物质，甚至剧毒的物质，微生物照样可以视为美味佳肴。,二分裂是细菌最普遍、 最主要的繁殖方式。,能耐0196的低温，可在250300的高温条件下正常生
4、长。耐药性产生的原因。,微生物几乎无处不有，无孔不入，地球上有200万生物，其中微生物有20万种之多。,微生物的营养,营养 元素,碳源是构成细胞的重要物质。,氮是组成蛋白质和核酸的重要元素。,细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。,生长因子是某些微生物生长发育所必需，而其自身又不能合成的一类营养物质。包括维生素、嘌呤和嘧啶。,水占细胞浆的70%90%，是细胞的重要组成成分。,实验室中微生物的生长基质,培养基：人们提供微生物生长繁殖和生物合成各 种代谢产物所需要的按一定比例配制的 多种营养物质的混合体。 培养基中主要包含了微生物生长所需要的碳源、氮 源、无机盐及微量
5、元素。,影响微生物生长繁殖的因素,因素,营养,温度,pH,渗透压,其他,水份,其他因素： 温度 氧气 厌氧 光照 水份等,微生物存在,水 空气 衣服 地面 废水 排水口 洗手池 嘴,头发 皮肤 鼻子 肠道 食物 昆虫 动物 等等,杆菌(大肠杆菌),大肠杆菌(带鞭毛),微生物的主要类群,杆菌(碳疽),沙门氏菌,葡萄球菌,微生物的主要类群,链球菌,弧状菌,四叠球菌,黑曲霉菌,微生物的主要类群,丝状真菌,真菌的繁殖：分生孢子,微生物数量,时间,衰亡期,稳定期,对数生长期,延缓期,细菌能否无限繁殖下去？,微生物的生长规律,延滞期：细胞变大，细胞内RNA含量增高，培养基不丰富 时延滞期较长。 对数期：细
6、胞分裂最快，代谢旺盛，生长速率由营养成分决定。 稳定期：总体数量保持不变，开始产生代谢产物或开始形成芽孢。 衰亡期：由于代谢毒素的积累，死亡数超过新生数。,微生物的益处,啤酒，葡萄酒的生产 面包酵母的生产 奶酪的生产 醋的生产 酸奶的生产 维生素的生产 类固醇的生产 抗菌素、干扰素的生产 分解废物，循环利用 帮助肠道中的食物消化 除虫,& 微生物的害处,导致伤口感染 导致胃肠不适 引起感冒，咳嗽 尿道感染 败血症 癌症 脑脊膜炎 破伤风 艾滋病,热原与内毒素,许多细菌、病毒和真菌（如酵母菌）都能产生热原。 热原：是微量即可引起恒温动物体温异常升高的物质的总称 主要物质为细菌内毒素、胞壁酰二肽及
7、其他抗原抗 体复合物等。（家兔法进行检查） 细菌内毒素：一般指革兰阴性细菌细胞壁的结构成分，主要 是脂多糖。（鲎试剂法进行检查） 耐热性：250加热30min，才可彻底破坏； 滤过性：其体积小，约在15nm之间； 具有水溶性及不挥发性，可被活性碳吸附； 能被强酸、强碱及氧化剂破坏。,消毒、灭菌概念,概念,杀死所有微生物包括芽孢和繁殖体,杀死病原微生物,阻止或抑制微 生物生长繁殖,无活的微生物,2.消毒,3.防腐,4.无菌,消毒和灭菌前提条件： 清洗干净!,湿热灭菌比干热效果好,水蒸汽穿透力强,蒸汽凝结成水，放出潜热，提高物体温度,菌体蛋白质吸收水分易凝固,热力灭菌,化学消毒,第二部分 环境控制
8、要求,药品生产中微生物控制,为什么要对药品生产进行微生物控制？ 微生物可以致病甚至致命。特别是注射剂的危害（乙肝疫苗，刺五加）。 如果细菌得到了必要的养料、一定量的水份和合适的温度，它们就能迅速繁殖，它们繁殖的速度快得惊人。通常一个细菌在仅仅24小时后可产生出281兆(百万)个的细菌。,主要的微生物污染源,人员 设备 原辅料 法 环,人员与微生物,人员是洁净室中的最大污染源。 人在代谢过程中会释放和分泌污染物，人体表面、衣服能沾 染、携带污染物，在洁净室内的各种动作也会产生微粒和微 生物。GMP对人员有着严格的要求。,防范措施： 1.建立个人健康档案 新员工入厂全面体检，直接接触药品的生产人员
9、每年至少体检一次， 如发现有传染疾病应立即隔离。 2.清洁的个人卫生 勤洗澡、理发、剪指甲 正确的洗手、更衣流程及防护方式 3.洁净区内的自我约束 不佩带首饰，不化妆 进出次数应可能地少，在操作过程中应减小动作幅度 规范各类操作及避免违规行为,人员需要规范或注意的部分,净化工作服穿戴,一次更鞋：阻断外界粘在鞋底的垃圾、颗粒及微生物。相对而言， 脚底是最脏的部分。 脱去外套：阻断外界沉降在外套上的颗粒和微生物。 一更洗手：规范的洗手能消除手部皮肤的污垢和大部分的微生物。洗 手一定要用洗手液和充足的流水。 二更 带口罩：阻断鼻腔、呼吸道的微生物发散，洁净区内不能脱下口罩。 带发套：阻断头发、头皮表
10、面的微生物发散。保证发套完整的包裹头发。 穿连体服：阻断体表皮肤的微生物发散。洁净区内不能解开连体服。 手消毒：再次消除手部的细菌和微生物。75%的酒精能杀灭手部95%以上的 微生物。,人员进入洁净区的程序,No,Yes,大家来找茬-1,36,头发应完全包在帽子内,YES,NO,NO,大家来找茬-2,不能配戴手表、首饰,大家来找茬-3,定时或在任何关键操作前，应消毒手套,39,填写批记录后，手套应消毒,手的卫生,每只手可携带40万个细菌；刚洗过的手，每平方厘米也可检验出3200个细菌 。 110万个细菌/1cm2皮肤表面!,用流水（如自来水）洗手，能使手上的致病微生物减少80%； 用皂液充分洗
11、手，再用自来水冲洗能使致病微生物减少95%。 洗手后正确使用消毒剂能使致病微生物减少到99%。,洗手的重要性:,洗手的正确方法,1.用清水润湿双手及手腕以上10厘米,2.均匀涂上 洗手液,3.掌心相对， 手指并拢 相互摩擦,4.手心对手背沿指缝相 互摩擦交换进行,5.掌心相对，双手交叉， 沿指缝相互摩擦,6.弯曲各手指关节， 在另一手掌旋转搓 擦，交换进行,7.一手握另一手大拇指旋转搓擦，交换进行,8.搓洗手腕，交换 进行。,9.将手及手腕用水冲洗干净，最后才可以用干净的手将干净的水龙头关掉。,10.然后在烘手器下吹干,洗手手的细菌对照实验,未洗的手 漂洗的手 (只用清水),洗净的手 洗净的手
12、 (用皂液) (用消毒剂),设备与微生物,设备的卫生应从设备的设计开始，要求产尘少、脱落粒 子少、易清洗、消毒和灭菌。设备与物料的接触面不得与物 料反应，不得吸附物料，设备的内表面材质要平整、光滑， 凹凸不平的区域不仅不易清洗，而且易存留残液等，它将成 为微生物繁殖滋生的场所。管道的安装要避免批与批之间的 交叉污染，管道要能定期清洗消毒。 防范措施： 建立相应的设备清洁保养制度及规程 保持一贯的清洁状态，发现污渍、污水、残余物等应立即清除 机修人员在线维修设备时，应注意操作尽量减少对药品产生污染 对直接接触药品的设备进行清洁验证,物料与微生物,对于物料卫生的问题，从供应商的审计、物料进厂后的检
13、 验、使用全过程，均要严格按照GMP规定的卫生要求进行。 我公司物料主要包括：原辅料、接口、盖子及工艺用水。 防范措施： 正确的原辅料的脱包、消毒、运送(容器)及投加操作。 正确的胶塞清洗流程。 对精洗残余水、胶塞清洗水及工艺用水的定期监测。 原辅料使用前的抽检。,操作方法与微生物,洁净区人员的操作是否规范，影响药品灭菌前的微生物 负荷，最终将影响产品的无菌保证值(SAL)。 F06D121+D121lgN0 F0 :标准灭菌时间; N0：产品灭菌前的带菌量； D121：在121下杀灭90%微生物所需时间。 防范措施： 制定日常操作的规范并严格执行。 直接与药品有接触的操作应带无菌手套并频繁冲
14、洗，操作过程中动作不宜过大。 加强对微生物知识的了解，增强无菌操作意识。,环境与微生物,环境中的微生物种类繁多，主要有附着于尘埃上的从地面飞起的 球菌属（包括八叠球菌属在内的好氧菌）；形成孢子的好氧性杆菌 （如枯草芽孢杆菌）；青霉等霉菌的孢子等。微生物的存在严重影响 着药品生产的安全，依次必须加以严格控制。,防范措施： 1.合理的厂房布局及高效的空气过滤系统 2.完善的洁净区日常卫生管理 3.每周进行空气消毒(臭氧熏蒸) 4.定期对洁净环境进行监测,洁净度测定包括： 微生物 - 浮游菌 悬浮粒子 - 沉降菌,新版GMP对洁净区微生物的动态要求,我国-WHO洁净级别标准,无菌产品洁净级别的确定,
15、A级：高风险操作区，如：无菌灌装区，灭菌后的内包装容器暴露的区域及无菌装配/连接操作的区域。 通常用层流操作来维护该区的环境状态。层流系统在其工作区域必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。 B级：指A 级区所处的背景区域。 C级和D级：指生产无菌产品过程中重要程度较次的辅助操作区，除菌前药液的配制，容器具处理、包装材料清洗等区域。,悬浮粒子的要求：附录1 第九、十条 1、A级区确认时的采样量不少于1m3 2、洁净区的动态监测 悬浮粒子的动态监测 关键操作的全过程，对A级区进行粒子监测 A级区的监测频率、取样量，及时发现人为干预、偶发事件及任何系统的破坏 B级区：类似于A级区，
16、采样频率、采样量可以调整 C级区：质量风险管理原则确定 D级区：一般不作要求，（法规：必要时） 对于C/D级区的自净时间应达到规定要求,控制微生物污染途径环境控制,控制微生物污染途径环境控制,微生物的要求：附录1 第十一条 监测方法有： 1.空气浮游菌监测 沉降菌法-被动法 定量空气浮游菌采样法-主动法 2.环境表面监测 表面取样法（如棉签擦拭法和接触碟法） 3.人员监测 表面取样法（接触碟法）,52,1.空气浮游菌监测 沉降菌法-被动法 沉降碟在空气中的暴露时间 4小时 监控整个灌装过程 只能给出定性和半定量的数据 应结合空气浮游菌的数据，对沉降碟的结果进行评价 定量空气浮游菌采样法-主动法 撞击式，离心式和膜
