工程合成生物构建技术2014---1课件

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1、现代制药工艺学-生物制药工艺研究,赵广荣 2014-10-22,现代制药工艺学-生物制药部分的基本要求,(1) 了解前沿进展 (2) 掌握基本原理和技术 (3) 能设计相关工艺实验研究的技术方案 (4)重点掌握授课内容 (5)下载相关文献,掌握其中核心知识和技术,主要内容,第一讲 工程生物的构建原理与技术 第二讲 青蒿素前体的合成生物技术 第三讲 重组人干扰素产品创新与工艺研究,工程生物 engineered organisms,通过基因工程、转基因、合成生物学等工程技术创造的生物 重组微生物，合成微生物 转基因植物 转基因动物,工程生物,1998-2002年，欧盟第五框架计划实施细胞工厂(c

2、ell factory)项目，其目的是全面了解应用微生物。 美国：生物学角度，最小基因组(minimized genome)是由一套生物生存必需的最小基因组成。 日本：2001年，从工业应用角度，具有最小基因组的工业微生物就是最小基因组工厂（minimized genome factory）。最小基因组工厂是具有工业生产必需基因，而非必需基因和有害基因已经被删除的微生物。它不仅简单，而且是又容易工业过程控制。 2002年创办国际刊物Microbial Cell Factories，报道微生物细胞作为重组蛋白、天然产物的生产者，或生物转化的催化剂等方面的研究进展和论文。 中国：2010年以后，人

3、工细胞工厂，人工生物体系，人工生物系统,最小基因组工厂,继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。,合成生物学（synthetic biology）的概念,合成生物学,按照人类的目的设计并创造新的生命元件器件，功能模块乃至自然界不存在的生命系统; 对现有的生命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。 合成生物学的核心思想是，认为生命的所有元件都能由化学方法来合成制造，并进而通过工程化方式组装成实用的生物体。,1911：柳叶刀，出现“合成生物学” 2000年以后，迅速发展，注意力转向该领域 2004年（MIT）Technology Review，合成生物

4、学评为“将改变世界的十大新技术”之一 2004年开始，全球iGEM比赛（大学生遗传机器作品） 2004年6月：MIT，第1届合成生物学国际会议(SB 1.0) 2005年5月：UC伯克利,SB 2.0；2007年6月，瑞士，SB 3.0 2008年10月：香港，SB 4.0；2011年6月: Stanford U,SB 5.0 2013年7月，英国伦敦，SB 6.0 2012年，ACS Synthetic Biology,合成生物学的学术交流,合成生物学,概述,2002年Cello 等合成脊髓灰质炎病毒的cDNA（Science, 2002，297：1016-1018）， 2005年Endy等

5、合成噬菌体T7基因组（Mol Systems Biology，2005，1：1-10） 2007年Craig J.Venter研究所（CJVI）实现了基因组的物种间人工移植（Science，2007，317:632-638） 2008年该所人工全合成了生殖衣原体细菌基因组（Science, 2008，319：1215-1220） 2009年利用酵母对克隆的基因组进行工程化组装（Science, 2009，325:1693-1696）， 2010年CJVI合成活细菌 2011年合成酵母染色体臂 2014年，合成酵母III号染色体,基因组合成的技术发展,从头合成DNA的里程碑事件,1955, 二聚

6、体 dTdT (2 nt) 1968, 酵母丙氨酸转移RNA (77 nt) 1981, 人干扰素a (514 bp) 2002, 脊髓灰质炎病毒 (7501 bp) 2004, 6脱氧红霉素内酯B合成酶基因簇DEBS (31656 bp) 2008, 支原体基因组(582 970 bp) 2010, 支原体细菌 2014，酵母染色体,基因组工程,基因组合成,基因合成,合成生物学,合成生物的单元 合成生物的设计与优化,生物元器件,生物元器件,合成生物学与计算机工程的层阶比较,合成生物学,1、基因元件 基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。 特性：信号接

7、受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境。 功能元件：编码1个/组生化反应酶功能基因/基因簇；编码组成细胞组分蛋白质的基因 界面调控元件:包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因。,合成生物的单元,合成生物学,生物元器件,基因元件的图形编码-制图,复制子,启动子,阻遏子,诱导子,终止子,RBS,功能基因,MCS,抗性,合成生物学,生物元器件,基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。,生物部件：由一个或多个基因元件组成 最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的编码酶基因

8、表达盒。,启动区,功能基因,终止区,合成生物学,生物元器件,生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能。 如代谢途径、信号转导途径、调控途径等。 模块：通过某种（逻辑/功能）关系把生物元件连接而成 与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因线路（genetic circuit）。 按功能分为:代谢线路,调控线路,信号线路等,生物模块与基因电路,合成生物学,生物元器件,Endy D提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、解耦联和抽提。 标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述。 解耦联：复杂

9、系统解分成具有独立功能的简单组分。 抽提：建立元件和模块的层阶。,合成生物的设计与优化,合成生物学,生物元器件,抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。 功能模式：基因表达调控的操纵子模型。 优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。 适合于不同宿主表达的生物元件。,1、生物元件的设计与优化,合成生物学,生物元器件,生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。 优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化。,2.基因电路的设计与优化,合成生物学,生物元器件,iGEM（International Genetically

10、 Engineered Machine）竞赛，在美国麻省工学院（MIT）收集每年参赛者贡献的生物元器件，建立了标准生物元件库（Registry of Standard Biological Parts）(http:/parts.igem.org)。 经过10年的收集，该文库的元器件以BBa为字头，容量已达到约2万个。,生物元件库,合成与装配,数据库RegulonDB中，大肠杆菌天然操纵基因中有1000余个启动子，及其他功能元件序列。 数据库BIOFAB（International Open Facility Advancing Biotechnology，http:/biofab.org/da

11、ta）有数千个人工合成并表征的启动子、核糖体结合位点等元件。 天津大学生物信息学中心建有必需基因数据库（http:/ 人工合成新生物系统,模块设计,抽提,工程生物构建的基本过程,基因元件设计,基因线路合成,制药工程生物,功能底盘细胞,遗传转化,底盘细胞设计,基因组编辑,基因元件合成,适配性筛选,氨基酸，维生素，抗生素，抗癌药物，聚酮，萜类等,第一讲 工程生物的构建原理与技术,DNA体外重组技术/基因工程 生物元件的组装技术/元件工程 基因组的编辑技术/基因组工程,体外重组是把不同来源的DNA分子用特异性酶切割，然后将两者连接成杂合分子。 体外重组的两大工具: 核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀

12、和胶水。,DNA 片段1 DNA 片段2,酶切,可连接的片段,载体,重组DNA分子,连接酶,DNA元件的体外重组,基因的体外重组,基因重组示意图,载体/质粒 酶：限制性内切酶，连接酶，聚合酶,DNA体外重组工具,基因元件载体,载体/质粒Vector：基因的携带者,复制起始点 选择标记 多克隆位点,质粒载体,基因元件的载体,1.结构,自主复制性:复制起始点以及控制复制频率的调控基因。 不相容性:具有相同或相似复制子结构及特征的的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。 转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。 选择标记：抗生素抗性基因等。 表达功能:能转录、翻译合成外源基因的产物。,基因元件的载

13、体,2.质粒的特性,克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。 测序质粒：用于基因测序。 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。 表达质粒：能表达基因产物。,基因元件的载体,3.质粒的类型,噬菌粒载体：由丝状噬菌体DNA复制起始位点序列与质粒组成的杂合分子。 M13噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。 特点： 象质粒一样，自主复制而稳定遗传。 象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。 基因在M13载体和质粒载体之间的转移。 激活过程：辅助丝状噬菌体感染带有噬菌粒的受体细胞，反式激活噬菌粒上的间隔区位点，启动噬菌粒以丝状噬菌体DNA的复制模式进行复制。分别包装成颗粒并分

14、泌到受体细胞外。,基因元件的载体,噬菌粒载体,含有噬菌体f1间隔区的载体： pBS ，pGEM 11Zf，pBluescript。,基因元件的载体,由 DNA的cos区与质粒DNA重组而成，主要用于基因文库的构建。,DNA cos位点及其附近区域的DNA片段为1.7 kb 质粒DNA为3.3 kb 构成的黏粒总共5 kb 最大装载量达45 kb,基因元件的载体,黏粒载体，考斯质粒,大肠杆菌-哺乳动物细胞 穿梭载体,pUC复制子， C31 整合酶，位点特异性整合在链霉菌基因组的 att位点 oriT 大肠杆菌与链霉菌接合转移 aac3(IV) 安普抗性基因，大肠杆菌和链霉菌中筛选标记 BamHI

15、 克隆位点：天然产物生物合成基因簇,大肠杆菌-链霉菌穿梭载体,pRS313,大肠杆菌-酵母穿梭载体,酵母复制子,大肠杆菌筛选标记,大肠杆菌复制子,酵母筛选标记,多克隆位点,大肠杆菌-链霉菌-酵母穿梭载体,大肠杆菌-棒杆菌穿梭载体,KanR，可移动,整合表达载体,游离表达载体,概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 种类： I类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断部位不定。 II类限制性内切酶：严格识别, 特异性切割。 III类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和切点不同。,1. 概念与种类,限制性核酸内切酶,基本名称：生物拉丁文名称属名的第一个大写字母和种名的前两各小写字母缩写构成（斜体）。 如果酶存在于一种菌株中，加株名的一个大写字母。 如果酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，用一个大写字母表示这些非染色体的遗传物质。 酶名称的最后部分为罗马数字，表示该生物体中发现此酶的先后次序。 举例：Hind ，Haemophilus influenzae d 株中发现第三个酶。,2. 类限制性核酸内切酶的命名规则,基因的体外重组,4、5或6个碱基对，而且具有180旋转对称的回文结构。 Eco RI的识别序列为： 5 GAATTC