《分子生物学诊断技术进展课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学诊断技术进展课件（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,分子生物学诊断技术进展,张 正 北京大学人民医院,2,主要内容：,分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用 简单介绍实验原理 以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例 分子诊断技术在以下病原研究的应用进展 乙型肝炎 丙型肝炎 结核分枝杆菌,3,病原学检测常用的实验室技术,细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 血清学、免疫学诊断技术 电镜技术 分子生物学诊断技术,4,分子生物学诊断技术方法简介,5,分子诊断技术方法简介,2、多标靶同时检测 多重PCR 毛细管电泳 以测序分析为基础的检测技术,6,分子诊断技术方法简介,3、核酸杂交 DNA荧光原位杂交（FISH） 将标记的探针直接原位杂交到
2、染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。 线性探针分析法（LiPA） 杂交保护分析法（HPA） 4、质谱 利用色、质谱结合PCR技术,7,分子诊断的功能及扩展,病原的诊断和鉴别诊断 病原分型 病毒载量监测-个体化治疗的依据 疗效及预后标志 其他：病原感染中发生、发展各阶段,8,分子诊断的功能及扩展,疾病分型及意义 例如：HPV （30/100） 高危-16，18，31，45 低危- 6，11,9,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗 例1.,-北京地坛医院谢尧提供,10,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗 例
3、2. HBV-干扰素 HBV100pg/mL 1/30 阴转 (HBeAg HBeAb),11,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗 例3. HIV病毒载量与传播 15127人 流行病学调查415对伴侣 30个月 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA1500copies/mL 全阴,12,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗 例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发 15个二年持续缓解： 0 copy/mL 10个复发： 32250 copies/mL 17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高,13,耐药病原的分子诊断,WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用 HBV的YMDD变异 HIV
4、耐药,14,血制品筛查,300余万的血清阴性样品，分子生物学复测： HBV：47 HCV：10 HIV-1：2 -2001年剑桥资料 HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6% -Am. J. Chin Athol. 2000,15,在基础研究领域中的应用； 遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等 肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 骨髓移植、器官移植供体配型选择； 法医学、动植物学、古人类学、古生物学； 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测； 药物基因组学、耐药基因的检测，等等,分子生物学技术在其它领域的应用,16,简单介绍实验原
5、理,PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应) 荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增）,17,PCR原理:实质就是体外基因复制技术,加热变性95 C,靶序列引物退火55 C,引物延伸72 C,18,PCR 循环 第一步 加热变性,靶序列,靶序列,从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94下热变性1-4分钟，使之解为单链。,19,PCR 循环 第二步引物与靶序列退火,靶序列,靶序列,Primer 1,Pri
6、mer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55左右,20,PCR 循环 第三步 - 引物延伸,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3端A开始, 沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72左右,21,第1个PCR循环完成后,靶序列,靶序列,Biotin,Biotin,22,30次循环后靶序列扩增的数量,No. of No.
7、Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,23,探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。,荧光PC
8、R原理 TaqManTM技术,24,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization Complete,4. Detection,l,荧光PCR原理 TaqManTM技术,25,定量PCR测定的是扩增的指数扩增期; 定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）,定量PCR与定性PCR测定的区别,26,市场上常见的实时荧光PCR仪,27,临床标本,核酸提取技术,NASBA 扩增,ECL-化学发光标记检测,NASBA 扩增+分子灯塔检测 扩增过程中“分子灯塔” 即时同相检测,方法 1 - NucliSens ECL,方
9、法 2 - NucliSens EasyQ,加入裂解缓冲液和内置标准,NASBA测定原理,28,NASBA扩增原理,引物 1,逆转录酶,RNase H 引物 2,逆转录酶,T7 RNA 聚合 酶,引物 2,逆转录酶,逆转录酶,RNase H 引物 1,线性循环,扩增循环,29,NASBA 和 PCR 的不同,NASBA 扩增目标为RNA 同温扩增 连续扩增 扩增物为单链RNA 引物次序不包含於最终产物中,PCR 扩增目标为DNA 温度循环扩增 循环扩增 扩增物为双链DNA 引物次序包含於最终产物中,30,乙型肝炎检测标志物： HBsAg，抗-HBs, HBeAg，抗-Hbe, 抗HBc (Ig
10、G,IgM), HBV-DNA,Dane颗粒（完整的病毒）形态,乙型肝炎的分子诊断,31,乙型肝炎的分子诊断,1. 重要性 全球 20亿人感染 慢性 3.5亿人 中国、东南亚、非洲50肝硬化，70-90肝癌 7-30携带者感染变异体,32,2. HBV基因型与血清型关系及流行病学分布 基因型与血清型不完全一致 临床突变率不同 有地域分布特点,乙型肝炎的分子诊断,33,表1：,34,表1(续）:,35,3. 基因型与临床 实验室表现不同（表2） 病情与转归：C较B差 抗病毒治疗：A优于D B优于C adw/ayw 20:1,乙型肝炎的分子诊断,36,表2:,37,4. 一般实验室分型方法 测序
11、PCR-RELP（限制性片断长度多态性） PCR 核酸杂交（谱线探针法） 血清学：单抗可区分A-F各基因型,乙型肝炎的分子诊断,38,5. 抗病毒治疗的耐药性问题 拉米夫定耐药性的检测,乙型肝炎的分子诊断,39,拉米夫定耐药性的检测 耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关 I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异 II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异 YMDD变异：Y（酪氨酸） M
12、（蛋氨酸） V（缬）： YVDD变异 D（天冬氨酸） I（异亮）：YIDD变异 D（天冬氨酸） 最近报道： YSDD （ATG AGT ） 应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点,乙型肝炎的分子诊断,40,乙型肝炎的分子诊断,41,乙型肝炎的分子诊断,42,HCV的基因型/亚型,6个型，68个亚型,1a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m 2a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m 3a, b, c, d, e, f, g, h, i, k 4a, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o, p, q, r
13、, s, t 5a 6a, b, d, f, g, h, i, j, k, l, m, n,丙型肝炎的分子诊断,43,HCV基因分型方法,测序 型特异性引物PCR分型法 线性探针杂交（InnoLipa) 限制性片段长度多态性分析（RFLP） TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay,丙型肝炎的分子诊断,44,5UTR (5Non-Coding Region) 高度保守 HCV RNA诊断实验的常用区域 有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型 许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分型 TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay VERSANT
14、HCV Genotyping Assay (LiPA),HCV NS5B区 各亚型间基因差异较大 扩增效率较低 若成功扩增，序列分析可区别HCV各亚型。,HCV基因分型常选用的区域,丙型肝炎的分子诊断,45,临床工作,目前常用的基因型检测方法（RFLP, InnoLipa, Trugene) 通常建立在5非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是HCV RNA诊断实验的常用区域。 在临床工作中，对5UTR进行分型的RFLP, InnoLipa, Trugene分型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。 常只需将1型和4型与其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的
15、剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。,丙型肝炎的分子诊断,46,HCV 5UTR gene,Second PCR product=257bp,Scheme A,Cleavage with BsrB,Hinfand Hae,93 and 91bp,Genotype 2a and 2b,257bp,Genotype 3b,4a and 5a,127 and 91bp,104,74bp,160,74bp,2a,2b,160,74bp,234bp,3b,4a and 5a,Cleavage with Hae,Scheme C,Cleavage with Apo,183,74bp,257bp,4a,
16、1b,197bp,Genotype 1a, 1b and 6a,166/169 and 91bp,Cleavage with BstU,Scheme B,1a,227bp,5a,Genotype 3a,6a,257bp,HCV 5非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图,-北京大学人民医院肝病研究所提供,47,抗HCV的确认实验 确认的重要性（灰区的遗漏） 目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题 方法：例如： PCR 活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法 RIBA 3.0 抗体的确认 新流程：,丙型肝炎的分子诊断,48,抗-HCV筛查检测,报告,阴性,或,根据S/Co比值判定为阳性,所有阳性结果,高S/Co比值阳性*,报告,低S/Co比值阳性*,RIBA HCV检测,或,
