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1、第九章 临床病原体检测,提 纲,第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法 第二节：病原体耐药性检测 第三节：临床感染常见病原体检测 第四节：病毒性肝炎检测 第五节：性传播疾病病原体检测 第六节：医院感染常见病原体检测,教学目的与要求：,了解掌握临床病原体检查的主要内容（标本采集、标本验收、药敏检查、耐药性检测、临床常见病原体、病毒性肝炎、性传播疾病、医院感染） 、检测原理以及临床实际应用的重要意义。,重点与难点,标本采集的原则及各种检查方法的适用范围及其优缺点 药物敏感的常用试验方法及其特点 耐药菌检测试验 各种类型临床常见病原体的检查 甲、乙、丙型肝炎的检测方法 各种性传播疾病病原体的检
2、测方法、筛选试验、确诊试验及金标准 院内感染定义,提 纲,第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法 第二节：病原体耐药性检测 第三节：临床感染常见病原体检测 第四节：病毒性肝炎检测 第五节：性传播疾病病原体检测 第六节：医院感染常见病原体检测,临床细菌学检验的特殊性,依赖于细菌生长 采集时间 （发烧？） 运送方式 （密闭与否，保温与否？） 感染的细菌种类及生长特征 （苛养菌） 病人是否使用抗生素 （抗生素的影响） 其他：消毒剂，白细胞吞噬等 容易受环境中的细菌污染 采集方法 （无菌操作，避免污染） 放置时间 （及时运送，避免细菌死亡）,基本原则 1：正确的标本类型和采集部位以反映有效病程
3、2：采集和运送应无菌操作，避免污染 3：尽快送检 4：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标识 5：注意生物安全，标本用后要做消毒处理,一、标本采集和运送,（一）血液标本的采集,适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症的病人 酒精棉球消毒，防止污染。静脉采血后，将血液注入培养瓶内 。 采集时间：一般在抗生素使用前，于发热初期或高峰期采血。 采集频率：24小时内采血23次可提高阳性率，且在不同部位。 采血量：血液与培养基的比例为1：5-10，一般成人血量510ml，婴儿1-5ml。,（二）尿液标本的采集,首次晨尿，无菌采集中段尿10-20ml。 排尿困难者考虑导尿采集标本。 如考虑厌氧菌感染，采
4、取膀胱穿刺法采集标本。,（三）粪便标本采集,自然排便者：挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。 排便困难者：采用直肠拭子采集。 怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养液送检。 传染性腹泻应连续送检3次。,（四）呼吸道标本采集,类型：鼻咽拭、痰和经气管采集的标本。 采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口。 方法：（1）自然咳痰法：（2）气管镜下采集法；（3）气管穿刺法。 WBC 25/lp,上皮10/lp。 上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。,（五）脑脊液与其它无菌体液采集,临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中立即送检，
5、不得保存于冰箱中。 脑膜炎的主要病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌。,（六）眼、耳标本采集,（七）泌尿生殖道标本采集,性传播性疾病取尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等。 生殖道疱疹常穿刺抽取疱疹液。 盆腔脓肿患者则于直肠子宫凹陷处穿刺取脓液。 所有标本收集后于4保存直至培养,（八）创伤、组织和脓肿标本,损伤范畴较大的创伤，从不同部位采集多份标本 . 清除污物，以碘酒、酒精消毒皮肤. 开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶深部分泌物。 封闭性脓肿：无菌干燥注射器抽取。 疑为厌氧菌感染，取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检。,标本送检,标
6、本要求尽快送检，否则影响阳性率。 烈性传染病标本需专人护送。,二、标本的实验室质量评估标准,1标本必须注明姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检验项目等基本信自。 2仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4存放23天。 3检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。 4标本储存、运送方式不当，不予接收。 5明显被污染的标本不予接收。 6标本量明显不足的标本，不予接收。 7同一天申请做同一实验的重复送检标本(血培养除外)，不予接收。 8对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，要有
7、完善的防护措施，按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送。,标本是否合格，以保证检测结果的准确性！,三、检查方法,（一）直接显微镜检查 （二）病原体特异性抗原检查 （三）病原体核酸检查 （四）病原体的分离培养和鉴定 （五）血清学试验,（一）直接显微镜检查不染色标本,不染色标本：适用于检查生活状态下病原体的动力及运动状况。 方法：压滴法、悬滴法。 意义：在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显微镜观察病原菌的动力、活动方式。部分病原体可借此初步诊断，如梅毒螺旋体。,（一）直接显微镜检查染色标本,染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。 方法：革兰染色、墨汁染色、抗
8、酸染色、荧光染色,革兰染色,细菌的形态、染色性的特征,革兰染色,墨汁染色,荚膜抗吞噬 30%-50%的患者伴有免疫功能低下等疾病， 8%左右的AIDS患者伴有隐球菌性脑膜炎，预后极差。 中枢神经系统存活与脑脊液中缺乏抗体和补体激活系统有关 抗真菌治疗:两性霉素B,氟康唑,抗酸染色,荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物， 用形态学和免疫学相结合的可特异地家侧某些病原微生物的存在。,荧光显微镜用于标本经荧光染色 后直接检出某些病原微生物,荧光染色,SARS（severe acute respiratory syndrome ）病原体的确定。,直接显微镜检查电镜检查,电镜检查不常规用
9、于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值,电子显微镜发现为 某种冠状病毒,电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值,意义 无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有一定意义。 对正常菌群寄居腔道的分泌物图片镜检可提示进一步检查的步骤、采取的方法和确定分离鉴定病原体所需的培养基。,意义,3.由于临床标本中常含有一定的抗菌物质，以致分离培养可为阴性，此时的镜检往往可能在诊断是起作用。 4.荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物 5.电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值。,(二)病原体特异性抗原检查,利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测
10、抗原，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常以标本不同而各异。 标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能肯定诊断。 检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等,细菌的血清分型： O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成,利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原,检测细菌不同的抗原构造， 还可分析细菌的菌群和血清型， 如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属,（三）病原体核酸的检测,常用试验方法有： PCR。polymera
11、se chain reaction聚合酶链式反应，简称PCR技术。 核酸探针杂交技术 Realtime PCR 基因芯片等,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原
12、理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR扩增产物电泳,PCR的基本原理,PCR反应条
13、件 PCR过程 PCR的特点,PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌,2 ）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,PCR的类型和应用,研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建
14、，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他,（三）病原体核酸的检测PCR,PCR：一种体外基因扩增技术，对目的基因组DNA的信号进行放大。,（三）病原体核酸的检测Realtime PCR,实时荧光定量PCR：通过起始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现核酸定量的一种技术。 广泛应用于结核和麻风分枝杆菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨细胞病毒的检查,（三）病原体核酸的检测Realtime PCR,将大量核酸片段(寡核苷酸、PNA、cDNA、基因组DNA)以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素或其他方式
15、标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的有无和数量。该技术具有高通量、自动化程度高、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原微生物的16S rDNA及23S rDNA序列近几年被作为一个较理想的基因分类靶序列，其在进化压力下保持了高度的保守性，同时又具有一定的变异性，基因芯片技术通常利用病原微生物的这一分子生物学特性，实现多样本多病原微生物的同时检测。,（三）病原体核酸的检测基因芯片,意义,灵敏度高，是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。 特异性强，阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。 特别适用于目前尚不
16、能分离培养或很难分离培养的微生物。 适用于核酸变异的病原微生物，如病毒,（四）病原体的分离培养和鉴定,明确感染病原体 提供体外抗微生物药物敏感试验结果,1.细菌感染性疾病病原体的分离培养 分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤 根据临床症状、体征和镜下检查特征做出病原学初步诊断，选择最合适的培养方法，主要是选择适当的培养基、接种前的标本处理和确定孵育条件，然后根据菌落性状(大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等)和细菌的形态、染色性，检测细菌生化反应结果和血清学实验、动物接种实验(白喉杆菌)，对分离菌作出鉴定，也可借助于微量鉴定系统快速简便鉴定分离菌,（四）病原体的分离培养和鉴定,细菌分离培养与鉴定的结果评价： 正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。 存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考
