临床微生物学与检验课件

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1、2019/4/19,1,第三章 细菌感染的病原学诊断 褚云卓,2019/4/19,2,本章内容,第一节 标本的采集和处理原则 第二节 细菌的形态学检查 第三节 细菌的分离培养和鉴定 第四节 细菌的非培养检测方法,2019/4/19,3,第一节 标本的采集和处理原则,一、标本采集的一般原则 1早期采集 2无菌采集 3根据目的菌的特性用不同的方法采集 4采集适量标本 5安全采集,2019/4/19,4,第一节 标本的采集和处理原则,二、标本的处理 1. 对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检 2. 其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室 3. 若不能及时送

2、检，标本应置于一定环境中保存 4. 一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h,2019/4/19,5,.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防护 .标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出 .对于烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须按规定包装，由专人运送 .厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送,2019/4/19,6,第二节 细菌的形态学检查,1.包括不染色标本检查法和染色标本检查法 2.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量 3.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类 4.通过形态学检查可

3、得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义,2019/4/19,7,第二节 细菌的形态学检查,一、不染色标本 1.细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况 2.常用的方法有压滴法和悬滴法 有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显 的方向性位移 无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无 位置的改变,2019/4/19,8,第二节 细菌的形态学检查,3.有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定 如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似流星状运动的细菌，制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。,2019/4/19,9,第二节 细菌的形态学检查,二

4、、染色标本 （一）常用染料 1碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等 2酸性染料：有伊红、刚果红等 3复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料有荧光标记的抗体,2019/4/19,10,第二节 细菌的形态学检查,（二）常用的染色方法 1革兰染色（gram stain） 革兰阳性球菌 革兰阴性杆菌,2019/4/19,11,第二节 细菌的形态学检查,2抗酸染色 （acid-fast stain） 可将细菌分为两大类： 即-抗酸性细菌 -非抗酸性细菌,2019/4/19,12,第二节 细菌的形态学检查,3荧光染色 （1）荧光染色法敏感性强，效率

5、高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。 （2）主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。,2019/4/19,13,第二节 细菌的形态学检查,4.鞭毛染色 可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。 5.异染颗粒染色 用于白喉棒状杆菌染色。,2019/4/19,14,第二节 细菌的形态学检查,6.芽胞染色： 绿色部分 为芽胞,2019/4/19,15,第二节 细菌的形态学检查,7.墨汁染色: 一般用于新型隐球菌检查,2019/4/19,16,第三节 细菌的分离培养和鉴定,一、培养基的种类和选择 培养基的组成

6、成分、培养基种类、培养基的选择 二、分离及培养 细菌的分离、细菌培养方法 三、生化反应和鉴定 碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验,2019/4/19,17,第三节 细菌的分离培养和鉴定,一、培养基的种类和选择 培养基（culture medium） 是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。,2019/4/19,18,第三节 细菌的分离培养和鉴定,(一)培养基的组成成分 1营养物质 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、 无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子 2凝固物质 琼脂、明胶、卵白 3抑制剂和指示剂,2019/4/19,19,第三节

7、细菌的分离培养和鉴定,（二）培养基种类 1基础培养基（based medium） 2营养培养基（nutrient medium） 3鉴别培养基（diferential medium） 4选择培养基（selective medium） 5特殊培养基（special medium）,2019/4/19,20,第三节 细菌的分离培养和鉴定,1基础培养基 含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。,2019/4/19,21,第三节 细菌的分离培养和鉴定,2营养培养基（nutrient medium） 最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等,20

8、19/4/19,22,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3鉴别培养基（diferential medium） 糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-镁蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。,2019/4/19,23,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4选择培 （selective medium） SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到,2019/4/19,24,第三节 细菌的分离培养和鉴定,5特殊培养基 （special medium） 疱肉培养基、 巯基乙醇酸纳培养基,2019/4/19,25,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（三）培养基的选择 根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种

9、分离培养基。伊红美蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌。,2019/4/19,26,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（三）培养基的选择 从血液、骨髓中分离病原菌用血液增菌培养基,2019/4/19,27,第三节 细菌的分离培养和鉴定,1平板划线分离法 2斜面接种法 3液体接种法,二、分离及培养 （一）细菌的分离,4穿刺接种法 5倾注平板法 6涂布接种法,2019/4/19,28,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（二）细菌培养方法 1需氧培养法 2二氧化碳培养法 3厌氧培养法,2019/4/19,29,第三节 细菌的分离培养和鉴定,三、生化反应和鉴定 （一）碳水化合物的代谢试验 1. 糖（醇、苷）类发酵试

10、验 是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要,2019/4/19,30,第三节 细菌的分离培养和鉴定,2氧化发酵试验（O/F试验） 主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴 别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型 或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的 鉴别。,2019/4/19,31,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3半乳糖苷酶试验（ONPG试验） 迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为 阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验 主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,2019/4/19,32,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4七叶苷水解试验 主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。

11、 5甲基红试验 主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。 6VP试验 本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的 细菌，后者通常为阴性。,2019/4/19,33,第三节 细菌的分离培养和鉴定,2吲哚(靛基质)试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验 1明胶液化试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。,2019/4/19,34,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3硫化氢试验 培养基：醋酸铅培养基 应用：主要用于肠杆菌 科中属及种鉴别,2019/4/19,35,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4尿素分解试验 主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。 5苯丙氨酸脱氨酶试验 主要用于肠杆

12、菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。 6氨基酸脱羧酶试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,2019/4/19,36,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（三）碳源和氮源利用试验 1枸橼酸盐利用试验 用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。 2丙二酸盐利用试验 肠杆菌科中属间及种的鉴别。,2019/4/19,37,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（四）各种酶类试验 1氧化酶试验 主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。 2过氧化氢酶试验（触酶试验） 用于革兰阳性球菌的初步分群。,2019/4/19,38,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3硝酸盐还原试验 本试验在细

13、菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。,2019/4/19,39,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴别。 5卵磷脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴定。 6 DNA酶试验 在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生 DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌 产生此酶。,2019/4/19,40,第三节 细菌的分离培养和鉴定,8 CAMP试验 在链球菌中，只有B群 链球菌CAMP试验阳性， 故可作为特异性鉴定。,7 凝固酶试验 作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时

14、常用的一个试验。,2019/4/19,41,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（五）抑菌试验 1 O/129抑菌试验 用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属 对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。 2杆菌肽试验 用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别。 3奥普托欣（Optochin）试验 主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。,2019/4/19,42,第四节 细菌的非培养检测方法,一、免疫学检测 抗原检测、抗体检测 二、分子生物学检测 核酸杂交、聚合酶链反应、生物芯片技术 三、细菌毒素的检测 内毒素、外毒素 四、动物实验,2019/4/19,43,第四节 细菌的非培养检测方法,一、免疫学检测 （一）

15、抗原检测 免疫荧光技术是利用免疫学特异性反应与荧光 示踪技术相结合的显微镜检查手段。既保持了血清 学的高特异性，又极大地提高了检测的敏感性，在 细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接 法、间接法和免疫荧光菌球法。,2019/4/19,44,第四节 细菌的非培养检测方法,一、免疫学检测 （二）抗体检测 抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的 升高。因此用已知的细菌或其特异性抗原检测病人 血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为 某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的 致病菌和病程较长的感染性疾病。,2019/4/19,45,第四节 细菌的非培养检测方法,二、分子生物学检测 （一）

16、核酸杂交 DNA可进行变性、复性、杂交。我们利用这一特性，制备特定序列DNA片段，进行标记后用作探针，在一定条件下，按照碱基互补配对原则与标本中已变性的细菌DNA进行杂交，通过检测杂交信号确定是否发生杂交反应，从而鉴定标本中有无相应的病原菌基因。,2019/4/19,46,第四节 细菌的非培养检测方法,二、分子生物学检测 （一）核酸杂交 1. 探针的种类 （1）全染色体DNA探针 （2）染色体克隆片段DNA探针 （3）质粒DNA探针 （4）rRNA基因探针 （5）寡核苷酸探针,2019/4/19,47,第四节 细菌的非培养检测方法,2核酸杂交在临床细菌检测中的应用 （1）细菌分类鉴定 （2）细菌快速鉴定 （3）细菌耐药性的检测 （4）细菌毒素的检测 （5）细菌流行病学调查,2019/4/19,48,第四节 细菌的非培养检测方法,（二）聚合酶链反应 （ polymerase chain reaction