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1、第八单元 色谱操作,色谱分离条件的选择,吸附色谱的操作技术 操作形式： 吸附薄层色谱 吸附柱色谱,柱色谱法 经典的柱色谱法是将作为固定相的吸附剂装在一根玻管柱中(柱长一般从几十厘米到上百厘米不等)，从管顶加入样品溶液，再从管顶加人流动相。使流动相从上往下流过而使各种成分分离并依次流出色谱柱的过程称为洗脱。在洗脱时，可在柱的下端依次收集洗脱液并进行检查，每一份洗脱液从几毫升到几十毫升甚至几百毫升不等。整个分离过程需几小时甚至几天才能完成。经典柱色谱法主要用于分离和精制较大量的样品，通常适用于几十毫克到几十克样品的分离。 近几十年来飞速发展的高效液相色谱法采用远小于经典色谱法的色谱柱(柱长530c
2、m，柱内径0.24.0 cm)，较细的固定相(粒径510m)，用高压泵输送流动相，具有分离性能好、分析速度快、流出组分容易收集、可以在线检测和仪器化等经典色谱法所无法比拟的优点。,色谱柱的选择 色谱柱的内径与柱长的比例一般在1：101：20(30)之间。 有时为了获得好的分离效果，可采用细长的色谱柱； 有时为了从溶液中吸去某种成分、滤去不溶物以及在利用活性炭脱色时为滤去细微的活性炭颗粒或若硅胶的颗粒较细，而粒度分布范围窄，则可采用短柱(1：5)，这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量。 有的色谱柱下端有活塞,有的有塞板。,装柱 A干法装柱。直接用小漏斗将吸附剂均匀装入柱内的方法。 B湿法
3、装柱。将吸附剂装入盛有洗脱液的柱内，或将吸附剂与洗脱液混合成混悬液再装入柱中。 C操作要点 装柱前柱底要垫一层脱脂棉、玻璃纤维或塞板以防吸附剂外漏。干法装柱时要用橡皮槌轻轻敲打色谱柱，使吸附剂装填连续均匀、紧密，然后用洗脱剂洗脱并保持一定液面；湿法装柱时注意打开下端活塞，洗脱剂应始终保持一定的液面高度，为了增强分离效果，提高分离速度，可在柱面覆盖一层处理干净的均匀的细沙（石英沙、粗硅胶）。,根据所采用吸附剂的不同，装柱方法略有不同：,氧化铝 一般先准确量取一定体积的溶剂(Vo)，将色谱柱的活塞稍打开，将溶剂滴人接受器中，同时将氧化铝慢慢地加入，保持边沉降边添加的状态，直至加完。氧化铝加入速度不
4、宜太快，否则将带人空气泡。必要时可以在色谱管外轻轻敲打振动，使氧化铝均匀下降，并有助于赶走气泡。当采用活性较高的氧化铝进行色谱时，更应注意。待氧化铝加完后，仍使溶剂流动一定时间，然后将氧化铝上面的溶剂全部滴人接受器，准确量取接受器内的溶剂量(V1)。从VoV1之差，就可以知道氧化铝内包含的溶剂体积。这样在色谱过程中，就可以掌握大致在什么时候开始收集流出组分；当变换溶剂的时候，就可以知道新换溶剂大致在哪一流分开始。,硅胶 由于硅胶多为多孔性物质， 一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶剂一起倾人层析柱中，最好一次倾人，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使
5、硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果。另亦可采用干法装柱，将所需硅胶一次倾人柱中，然后蹾紧至硅胶高度不改变为止。 当采用分配层析时，应先将预先选定的固定相溶剂如水、缓冲液或极性溶剂加入硅胶中，一般比例为1：0.51较为适中，搅拌混合均匀，倾人预先选定的移动相溶剂中并激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡层析管中事先放人用固定相溶剂剧裂振摇饱和后的移动相，将上述吸着固定相的硅胶按湿法装柱，不断轻敲管壁，使均匀紧密另外亦可采用加硅胶于固定相饱和的移动相中，按湿法装柱，然后用固定相饱和的流动相通过硅胶柱，使达到层析时稳定的平衡条件,活性炭 因活性炭在水中的吸附力最强，一般在水中装柱。色谱柱内先加少量蒸馏水
6、，再以玻璃纤维塞住底部，并除去玻璃纤维中的气泡。活性炭以蒸馏水浸泡1h左右，不断搅拌除去气泡。然后倒人柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。 粉末活性炭因流速太慢，需与硅藻土(1：1)混合后，再用蒸馏水调成糊状装柱。并且待样品上柱后，在色谱管顶端连一有自动控制的加压泵或在色谱管下端连一减压泵进行色谱。,聚酰胺 预处理： 取聚酰胺粉以90一95乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入色谱柱中。用34倍体积的90一95乙醇洗涤，洗至洗液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用22.5倍体积，质量浓度为5的NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、22.5倍体积的10醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，备
7、用。 装柱： 若用含水溶剂系统洗脱，常以水装柱，方法同活性炭的装柱。 若用非极性溶剂系统洗脱时，常以溶剂组分中极性低的组分装柱。若以氯仿装柱，因其比重较大使聚酰胺粉浮在上面，加样时应将柱底端的氯仿层放出并立即加样，加样后顶端用棉花塞紧。在色谱柱关闭时，应将顶端多余的氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层带。,加样 样品上柱可采取二种方式： 湿法 干法,湿法 如样品能溶于移动相可用少量移动相溶解，制成体积小、浓度高的溶液，尽可能保留加样色带狭窄，轻轻注入已准备好的色谱柱上，上样时注意沿着柱内壁慢慢加入，始终保持吸附剂上端表面平整，勿使色谱柱面受到扰动，否则将影响色谱效果。,干法 如果样品难溶于移
8、动相或不易溶于开始色谱使用的有机溶剂，那么先将样品溶于易溶的、易挥发的有机溶剂中，以少量的吸附剂拌匀，然后将有机溶剂挥发干净，加适量的移动相拌匀再上柱，再按上述装柱法装柱，将带有样品的吸附剂加在色谱柱中的吸附剂上面。并在上面覆盖一薄层纯净的砂，然后用移动相展开,上样量 一般为上样量：吸附剂= 1：601：30 氧化铝的样品量 一般为1：2050，根据被分离化合物的性质而定。氧化铝对萜烯、倍半萜烯等的吸附力较弱，这时氧化铝用量可增至样品量的100200倍，而且为了尽量减少这类化合物在色谱柱中的扩散，色谱过程不能有间歇。 硅胶色谱样品量， 一般为1：301：60，若作为分配层析比例应加大，主要根据
9、分离物质的难易采确定较难分离者有时甚至可选1：5001：1000。 聚酰胺色谱样品量 一般每100m1聚酰胺可上样1.52.5g，实际上其比例视具体情况而定样品先用洗脱溶剂溶解，浓度约2030%。若不溶解于洗脱剂，可选用易挥发的有机溶剂溶解，拌入干粉中后将溶剂减压蒸去，湿法装入柱顶,洗脱 洗脱方式： 等强度（isocratic） 梯度 （gradient）,等强度洗脱： 在同一洗脱周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目少、性质差别不大的样品。,梯度洗脱： 同一洗脱周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。分析组分数目多、性质相差较大的复杂样品时须采用梯度洗脱技术，使所有组
10、分都在适宜条件下获得分离。 梯度洗脱能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度；但是常常引起基线漂移和降低重现性。,梯度洗脱曲线类型： 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程序进行混合，即有多种洗脱曲线： 线性梯度 凹形梯度 凸形梯度 阶梯形梯度,线性梯度最为常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱； 如果用等强度洗脱获得的色谱图前段峰重叠，后段峰分开且保留时间太长，可以适当降低起始溶剂的强度后，采用凹形梯度洗脱，梯度起始阶段溶剂强度低，使分离度增大，而末尾阶段溶剂强度迅速增加，使组分快速洗脱出柱；也可降低起始溶剂的强度后，采用快速线性梯度洗脱；或者采用阶梯式梯度洗脱。 总之，应该根据样品的
11、实际情况，选择适宜的梯度曲线、梯度速度和时间、梯度起始和结束的溶剂组成。,由薄层色谱摸索柱色谱条件 分离条件最佳与可用范围的k值表 k=0.4 ,Rf=0.7 k=4.0 ,Rf=0.2,注意： 洗脱时要尽量避免使用下列溶剂： A醇类、乙酸乙酯，如样品中含酯类易发生酯交换。 B丙酮 与硅胶作用 C甲酸、吡啶，溶解固定相,流速： 过快不能达到平衡 过慢色带扩散 最佳流速： 1V0 / 0.51h V0=流动相在色谱柱内所占体积 一般为上柱硅胶量的1.5倍;松的为2倍，紧的为1.2倍,流份收集体积： 过小 增加工作量 过大人为混合 一般流份体积: 1流份= V0 1 / 10,预测被分离物质的洗脱
12、体积 V保 = V0 / Rf 式: V0 =流动相在色谱柱内所占体积 V保 =保留体积(被分离物质的洗脱体积) 若Rf=0.1, 则 V保 = 10 V0 若Rf=0.2, 则 V保 = 5 V0 若Rf=0.3, 则 V保 = 3.3 V0,一般连续洗脱(柱色谱)的条件: 以TLC的 Rf=0.10.3条件为佳 先用单一溶剂, 若Rf值过大,则降低溶剂极性 若Rf值过小,则增加溶剂极性 若单一溶剂不能使Rf值=0.10.3,则用混合溶剂 一种溶剂 Rf=0 另一种溶剂 Rf=1 混合使 Rf=0.10.3. 若斑点较多,则选适当溶剂,使第一斑点展出,而其它斑点留在原点。,梯度洗脱起步溶剂的
13、确定: 极性小于洗脱剂, 一般为洗脱剂中极性小组分的2倍 例: CHCL3 : MeOH=10:1 ; 5:1 ; 2.5:1 ; 1:1 起步溶剂= 20:1,检测时,点样的物质有: 待分离物质(总样); 标准物质(对照品); 柱洗脱下来的各个流分,溶剂的重复使用： a若洗脱液为单一溶媒，则采用蒸馏法回收溶媒后，进行循环使用。 b若洗脱液为混合溶媒，应先回收溶媒，再进行调节密度。如；三元系统的洗脱溶媒CHCI3MeOHH2O= 6：4：2，新配制时d = 1.064, 回收溶媒后，用MeOH、H2O调节密度，再用TLC检查，与原斑点Rf值相同即可。,吸附剂的再生 用过的吸附剂经适当方法处理后
14、，可以重复使用。 A氧化铝 色谱分离后，除去氧化铝柱上端含聚合物及带有深颜色的氧化铝，用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后，可重复使用、。为了使吸附在氧化铝表面的有机物分解，高温活化时间可适当延长。活化后，氧化铝的颜色比使用后的稍淡，一般来说，氧化铝可重复使用多次，重复次数随色谱过程中有机物污染的程度而定。,B硅胶 由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单。一般可用乙醇或甲醇洗涤，或于索氏提取器中连续抽提除去杂质，洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。硅胶的再生也可用510倍体积，质量浓度为1的氢氧化钠煮沸0.5h如仍不呈强碱性(以酚酞作指示剂)，可追
15、加适量质量浓度为1的氢氧化钠，趁热过滤，以蒸馏水洗3次，再以36倍5盐酸煮沸0.5h，以蒸馏水洗至中性，120活化，过筛即得。,C聚酰胺 用过的聚酰胺粉，一般用5氢氧化钠洗涤，洗到氢氧化钠液颜色极淡为止。有时因某些鞣质与聚酰胺有不可逆吸附，用氢氧化钠很难洗脱时，可用质量浓度为5的氢氧化钠在柱中浸泡。每天将柱中的氢氧化钠液放出一次，并加入新的氢氧化钠液浸泡，这样浸泡洗涤一周后，鞣质可基本洗完。然后用蒸馏水洗至pH89，再以2倍量10醋酸洗，最后以蒸馏水洗至中性，即可重复使用。 D活性炭 用过的活性炭可以用酸碱处理回收。因活性炭来源较易，价格便宜，一般不回收使用。,薄层色谱法 优点： 所使用的固定
16、相是一次性的，因此样品的预处理比较简单； 被分离物质的性质没有限制，应用范围广 固定相特别是流动相选择范围宽：有利于不同性质化合物的分离；在同一薄层板上可根据被分离化合物的性质选择不同显色剂或检测方法进行定性或定量分析。 直观性，且随化学成分及显色方法的不同，斑点显色的颜色丰富多彩，有利鉴别。,制板 板 类型: 软板-不含黏合剂 硬板-含黏合剂的 前者系将吸附剂或载体直接在玻璃板上用干法涂成均匀的薄层，但软板疏松，操作很不方便，目前很少使用。 制备含黏合剂的硬板，必须先要制备固定相的匀浆，它是由吸附剂与黏合剂以一定的比例用水调和而成。由于固定相及黏合剂类型不同，性能也不相同，常用的黏合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠(CMCNa)和某些聚合物如聚丙烯酸等。,规格: 薄层所用的玻璃板为2mm厚，除另有规定外，一般为 5cm20cm
