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1、PCR技术应用进展及存在问题,卫生部临床检验中心 李金明,PCR?,PCR只是一个简单的不起眼玩艺 凯利穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow,Kary Mullis,什么是PCR?,我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，
2、学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。 凯利穆利斯（Kary Mullis),“ 真正惊人的是PCR完全不是为解决某一个难题而设计的,该技术成熟之后,它所能解决 的难题才开始涌现” 史蒂文沙夫,PCR技术的特点：高特异性,引物的特异性。 引物延伸时，碱基配对的正确性。 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。 靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。 作为临床测定的PCR方法，还有一个影响特异性的决定性因素是寡核苷酸杂交探针。,PCR技术的特点：高灵敏度,从理论上，其能在23小时内，将1个分子靶DNA，扩增至1
3、0亿个分子。 而就特定的扩增反应来说，从理论上，只要反应管中有1个分子，就能将其扩增至能检出的水平。如将一些干扰因素考虑在内，一个反应体系中，如有23个以上的靶分子，即可成功的通过PCR扩增，将其检测出来。,PCR技术的特点：简便快速,整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的Taq DNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。 整个扩增反应可在24 小时完成。,特定的低纯度标本也可使用,某些靶基因含量高的标本，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等，DNA粗制品及总RNA即可作为扩增模板，但在具体的扩增时，可对标本进行适当的稀释，在
4、不影响靶基因模板的扩增浓度下，降低标本中PCR抑制物的浓度，以利于靶基因的扩增。,PCR技术的应用,病原体核酸的检测：定量（抗病毒药物治疗疗效监测）；定性（耐药突变、基因分型、血液筛查等）。 遗传病 肿瘤 个体鉴定 其他（SNP及涉及核酸的科研等）,在感染性疾病病原体检测中的应用,病毒的检测 定量(感染状况判断、抗病毒药物治疗疗效监测） 定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等） 细菌及其它微生物的检测 难培养菌 耐药基因 寄生虫的检测,在遗传病及其它基因相关疾病诊断中的应用,地贫 地贫 血友病 药物性耳聋,地中海贫血,地中海贫血是一种常染色体遗传性溶血性贫血,是世界上最常见和发生率最高中的一种单
5、基因遗传病。 地中海贫血是由于珠蛋白肽链合成障碍所致，出现一种或几种珠蛋白肽链数量不足或完全缺乏，从而造成这种珠蛋白链参与的血红蛋白合成量的减少。各珠蛋白链本身的氨基酸顺序并无异常。其中珠蛋白链合成受抑者，叫做“地中海贫血”；珠蛋白链合成受抑者，叫做“地中海贫血”。,地中海贫血,地贫的发生是由于珠蛋白链基因突变的结果，珠蛋白基因定位于第16染色体短臂，每条染色体上均有两个珠蛋白基因，该基因总长30Kb，共包含七个连锁的类基因或假基因。 在-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。-基因的另一突变即为点突变，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无意突变、剪接部位突变及起始信号突变。 地贫的
6、产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）方法进行。,地中海贫血,地中海贫血（简称地贫）:地贫由珠蛋白链基因突变所引起，该基因定位于第11染色体短臂，总长度约60Kb，其中有许多胚胎性基因及假基因，而珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子，总长约为1.126Kb. -基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺失。目前在世界范围内发现的点突变达160余种，其中在中国发现的有21种。 地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）或等位基因特异的PCR方法进行。,血友病,血友病是一种X连锁隐性遗传病，分为血友病甲和血友病乙，几乎全部发生在男性身上。血友
7、病甲是由于凝血因子的缺乏所致，而血友病乙则是因为缺乏凝血因子。控制产生凝血因子和的基因位于X性染色体上。,母亲为血友病基因携带者时致病基因遗传,每个儿子患血友病及每个女儿为致病基因携带者的机会均为50%,父亲为血友病患者时的致病基因遗传,所有儿子都正常，所有女儿都是携带者,父亲为血友病患者母亲为携带者时的致病基因遗传,每个儿子和女儿患血友病及每个女儿为致病基因携带者的机会均为50%，儿子有一半正常,血友病的分子诊断,大多数血友病突变的大量变异和近代起源使遗传筛选过程错综复杂。目前基本上使用PCR方法检测。 诊断携带者的最佳途径是检测其家庭成员的特异基因缺陷。 策略：根据全国性可信基因突变和谱系
8、数据库进行筛选，鉴定并记录每一个家庭中的病人或携带者的突变。这样，根据个人所属家庭，只有小部分血友病基因需要检查，所以可以迅速而准确地筛选每一个家庭成员并降低成本。 英国和瑞典完全使用这种策略，它代表了利用各种遗传缺陷谱系鉴定遗传性疾病的筛选模式。,药物性耳聋,我国目前聋哑患者约有1770万，居残疾人之首。耳聋分先天性和后天性两种。在后天性耳聋中，药物性致聋发生率占40。而在药物引起的耳聋者中，3岁前发病为50，7岁前可达82。其元凶是氨基糖甙类药物，如链霉素、丁胺卡那霉素与庆大霉素、妥布霉素及核糖霉素等，它们均能摧毁毛细胞与螺旋形神经节，以而使听觉传导系统受到严重损害，并导致病人耳聋。,药物
9、性耳聋,氨基糖甙类抗生素所致的耳聋可分为两类：一类因接受了中毒剂量而致聋；另一类是有遗传背景，即带有线粒体125rRNA基因AI555G均质性点突变基因。由细胞线粒体的遗传基因发生变异之故。即家族的变异基因可能通过母亲遗传给她的子孙，使之具有潜在的过敏性，此称母系遗传。 该突变使原有的BsmAI酶切位点消失,药物性耳聋,检测方法主要是运用 PCR技术，结合限制性内切酶进行分析，其更新的技术包括变性高效液相色谱分析等。,在亲子鉴定中的应用,每个人的遗传物质一半来自父亲，另一半则来自母亲。根据孟德尔遗传分离和自由组合定律，亲代基因型决定子代基因型，在没有基因突变和分型错误的前提下，孩子不可能带有双
10、亲均没有的等位基因。 父系遗传的Y染色体的标记，子代的分型必定与父亲的相同，而且同一父系的所有个体的分型一致。母系遗传的线粒体DNA，子代的分型与母亲的分型一致，并且同一母系的所有个体的分型一致。,在亲子鉴定中的应用,父与子之间仅有一个遗传标志不符合遗传规律尚不能排除亲子关系，因为有可能是突变所致。必须有2个以上不同基因座同时不符才能否定其亲子关系。 亲子鉴定的手段主要有两大类: (1)血液中各种抗原成分的遗传多态性标志物检验,如人类白细胞抗原分型、红细胞抗原分型、红细胞酶型及血清型；（2）DNA多态性检验。主要包括有单基因座探针限制性片段长度多态性（DNA指纹）和单基因座扩增片段长度多态性（
11、包括用多聚酶链反应(PCR) 检测的可变数目串联重复多态性(VNTR)和短串联重复多态性(STR)）。,在亲子鉴定中的应用,DNA多态性检验是目前亲子鉴定中最准确的一种方法。 如果孩子和被测试男子的DNA模式在两个或多个DNA探针上不吻合,那么被测试男子便被100%排除,即他是亲生父亲的可能性是0%。反之，如果孩子和被测试父亲的DNA模式完全吻合,则在理论上不能100%肯定其为亲生父亲，只能计算出99.95%或更大的概率。 事实上也发生过DNA模式完全吻合但实际并非为生父的情况，但这种情况的可能性极低。,在个体鉴别中的应用,基因指纹又称DNA指纹，指的单基因座探针限制性片段长度多态性。DNA所
12、含有的遗传信息是由遗传密码字母A、C、G和T的序列决定的。人类含有总数约30亿个这种字母，它们在人体每个细胞的染色体上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一个个体与另一个个体完全不同。个体间的亲缘关系相距越远，基因组的核苷酸字母排列差异就越大。相反，遗传上相关的个体（如同胞、父子）相应地在其字母序列上有很大的相似性。,在个体鉴别中的应用,DNA指纹就是通过分析这种差异来确定个体。 DNA指纹是最可靠的个体确认方法，现已在司法实践中广泛应用，有很多案例的唯一证据就是留在现场的这些藏在细胞内的DNA。,在恶性肿瘤诊断中的应用,肿瘤诊断 肿瘤疗效观察 肿瘤的转移,在个体化治疗中的应用,细胞色素氧化
13、酶P450（CYP450基因的多态性 细胞色素P450 2D6（Cytochrome P450 2D6，CYP2D6）是细胞色素药物代谢酶中较为重要的一种，由497个氨基酸组成。主要参与多种重要药物的代谢，包括多种抗心律失常药、1受体阻滞药、抗高血压及三环类抗抑郁药等。CYP2D6参与代谢的药物占总P450代谢药物的30%。 CYP2D6的基因多态性会导致患者代谢药物能力的很大差别。当患者的基因型是CYP2D6*1/*1时，属于强代谢型（EM）；当患者的基因型是CYP2D6*1/*10时，属于中等代谢型（IM）；当患者的基因型是CYP2D6*10/*10时，属于弱代谢型（PM）。同样是美托洛尔
14、用药的常规剂量为25mg/次，2次/d，对于EM者，推荐剂量为常规剂量的140%；对于IM者，推荐剂量为常规剂量的60%；对于PM者，推荐剂量为常规剂量的30%。 可常规地应用不同的P450基因型来评价新药在临床试验中的疗效。,在血液筛检中的应用,HCV和HIV感染“窗口期” HBV DNA PCR检测筛检血液的意义,其 它,Immuno-PCR,PCR应用存在的问题,病原体 遗传病 肿瘤,定量PCR测定的临床应用 及应注意的问题：病原体,为什么要做定量测定？ 定性和定量测定结果报告上的混淆。,为什么要做定量测定？,用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果的动态观察及抗病毒药物的临床研究；细菌、支原
15、体、衣原体等一般不需要做定量检测。 用于基因表达方面的研究，如特定的mRNA的定量测定。,定量测定的结果报告,定量测定测定的是量的“多”或“少”.用于已知患者的抗病毒治疗的动态观察. 定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。,定性测定,定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。 什么样的病原体感染用定性测定? 细菌性感染、一过性的急性病毒性疾病、支原体和衣原体感染、寄生虫病等。,遗传病检测的问题,认识的简单化
16、、依赖于商品试剂盒 检测与临床结合不足,肿瘤检测的问题,滥用 没有经过批准的商品试剂,个体化治疗的检测问题,“概念”,基因芯片,“概念” 哪个项目需要多个指标同时进行检测的，这种同时检测能带来什么样的方便或快捷，并且将新方法与现有方法比较，有什么样的优点。 技术或方法的成熟程度 判断的最简单的方法：找35份含不同浓度特定分析物的临床标本，用其重复检测20次，观察结果是否一致，如出现不一致（哪怕是只有1次不一致），就不能用于临床检测。,临床PCR检验的标准化,方法试剂的标准化 核酸提取 “内标”(Internal control)的应用 工作程序的标准化 标本采集、运送、管理、检测、质量控制、结果报告和解释 标准物质的研究,临床PCR检验应用的发展趋势,核酸提取方法的简便化和自动化 项目的多样化：从病原体、到基因疾病的诊断、多标志物同时检测、疾病基因指纹 不同原理的实时核酸扩增仪的普遍应用 扩增试剂的改进：标准化、防污染、有内标阴性质控 临床PCR实验室质量
