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1、指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。,细胞工程,应用的原理 和方法,细胞生物学和分子生物学,细胞水平或细胞器水平,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品,概念,分类,植物细胞工程,研究的目的,研究的水平,动物细胞工程,主要技术,植物组织培养,植物体细胞杂交,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,植物细胞工程技术,动物细胞工程技术,前者是细胞水平或细胞器水平上生物技术, 后者是分子水平上的生物技术。,克隆多莉羊技术是 水平上的技术， 培育抗虫棉是 水
2、平上的技术。,细胞工程与基因工程相比：,细胞,分子,思考:,所采用技术的理论基础,植物细胞工程,通常采用的技术手段,植物组织培养,植物体细胞杂交,植物细胞的全能性,科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。,1958年Steward和Reinert用胡萝卜根的愈伤组织诱导成了体细胞胚，并进而获得了完整植株。,植物组织培养的发展简史,细胞的全能性,(1)概念,1）受精卵,生殖细胞,体细胞,：生物体的细胞具有形成完整个体的潜能的特性，叫做细胞的全能性。,(2)原因,(3)全
3、能性的比较,：从理论上讲，每个有核活细胞都包含该物种的全部遗传物质（全部基因），所以每个活细胞都应具有全能性 。,2）植物细胞全能性一般比动物细胞强,(3)细胞表现出全能性的条件,离体状态 有一定营养物质、植物激素和其他外界条件,思考讨论：为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？,基因在特定空间和时间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。,试管苗大规模培养,过程,离体的植物器官、组织或细胞,愈伤组织,胚状体（根、芽）,植物体,外植体,脱分化,植物激素： 细胞分裂素、生长素,再
4、分化,植物组织培养的培养基,无机营养成分：水及矿质元素（无机盐） 有机营养成分 含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2%5%的蔗糖 琼脂：起支持作用 相关激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素 PH值：5.06.0 光照：前期不要，后期必要，有助细胞生长分化,植物组织培养,培养容器的培养基要高压蒸汽灭菌 外植体消毒接种（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等） 整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！,【实验 胡萝卜的组织培养讨论】,1.在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？ 提示：植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成分，有利于外植体的生长，然而各种杂菌同样也可以在上面迅速
5、生长，所以植物组织培养过程中污染现象经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速死亡。 造成培养基污染的因素有很多，一般包括：外植体带菌、培养瓶和各种器械灭菌不彻底、操作人员操作不规范等。所以在组织培养实验中用到的植物材料和各种器械都要进行彻底地灭菌，实验人员操作一定要规范，避免带入杂菌。,比较脱分化再分化：,生长素有利于根的分化，分裂素有利于芽的分化。,2.在本实验中，切取胡萝卜块根时强调要切取含有形成层部分，原因是这部分容易诱导形成愈伤组织。请思考一下，胡萝卜的其他部分（如茎、叶），是否也能培养成
6、小植株，你能用实验的方法进行验证吗？ 提示：胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花）也能培养再生形成小植株，只是分化较大，诱导愈伤组织比较困难。,（1）外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。 （2）愈伤组织：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。 （3）胚状体：由愈伤组织分化出的与种子胚类似的结构。 （4）脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。 （5）再分化：脱分化产生的愈伤组织重新分化成根或芽等器官的过程。,植物体细胞杂交技术,1972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。,背景资料,1978年梅尔彻斯(Melche
7、rs)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种“Potamato”。,目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。,植物体细胞杂交过程示意图,纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，形成原生质体。 原理：酶的专一性、高效性,（1）原生质体制备,（2）诱导原生质体融合,是关键环节 根据的原理是:细胞膜的流动性 方法:物理 离心、振动、电激 化学 聚乙二醇(PEG)作诱导剂 成功标志是: 杂种细胞产生了新的细胞壁,（3）组织培养,根据的原理是:细胞膜全能性 过程:脱分化 再分化,植物体细胞杂交技术流程重
8、点理解以下内容：, 流程图中为了简化，仅画了一个马铃薯的原生质体与一个番茄的原生质体之间的融合，可真正在实际操作过程中，是把许多马铃薯的原生质体和许多番茄的原生质体放在一起，让它们自由融合出现多种融合，必须从中筛选出所需的杂种细胞。 由于不同种的细胞其细胞膜的特点不一样，如不作任何处理，把它们放在一起，让它们自然融合是不可能的，所以原生质体间的融合必须要人工诱导。,（3）组织培养得到杂种植物,克服远源杂交不亲和的障碍，培育出自然界中没有的、具有优良品质的新品种。 成果,植物细胞工程的实际应用,一、植物繁殖的新途径,1.微型繁殖 (1)微型繁殖技术:快速繁殖优良品种的植物组织培养技术. (2)特
9、点: 保持优良品种的遗传特性; 高效快速地实现种苗的大量繁殖.,2.作物脱毒 (1)材料:无病毒的茎尖 (2)脱毒苗:切取茎尖进行组织培养获得,3.神奇的人工种子 (1)特点: 后代无形状分离 不受气候,季节和地域限制 (2)技术:植物组织培养. (3)结构:人工薄膜胚状体或不定芽或顶芽或腋芽.,二、作物新品种的培育,1.单倍体育种 (1)方法:花药的离体培养 (2)优点: 后代稳定遗传,都是纯合体; 明显缩短育种年限.,2.突变体的利用 (1)产生:植物组织培养诱变，更易发生基因突变 (2)利用:筛选对人们有利突变体,进而培育新品种,三、细胞产物的工厂化生产,1.种类:蛋白质,脂肪,糖类,药
10、物,香料,生物碱等. 2.技术:植物的组织培养.,动物细胞工程,一、动物细胞培养,1、发展历史： 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞与周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。 1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。,2、动物细胞培养的应用和概
11、念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官 和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术：是其他动物细胞工程技术的基础 原理：细胞增殖（有丝分裂）,3、动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解细胞）,注意： 1、选材 2、胰蛋白酶 3、分散单个细胞 4、
12、贴壁生长 5、接触抑制 6、原代培养、传代培养 7、培养液成分,有关概念:,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。初次培养称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种10-50代的传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种50代以上的传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细
13、胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,3.动物细胞培养的条件:,1.无菌无毒的环境 2.营养 3.温度和pH（36.5 7.2-7.4） 4.气体环境（95%空气+5%二氧化碳）,4.动物细胞培养技术的应用:,1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.健康细胞培养 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植 3.细胞的生理、药理、病理研究,植物组织培养和动物细胞培养的比较,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.,核移植技术,1.克隆羊培育过程,另一头
14、绵羊的子宫,注意：卵母细胞培养至M，才能用于去核构建 重组细胞。 胚胎移植的受体牛要进行同期发情，使生理状况相同。,2.体细胞核移植技术的应用前景,动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,动物细胞融合,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法：电刺激 化学法：PEG,仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。 思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能结合细胞膜上，并使蛋白质分 子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合， 不灭活的话
15、会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,细胞融合技术应用于哪些方面？,细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,二、单克隆抗体,什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 浆细胞产生抗体。,B淋巴细胞与抗体的关系：,B淋巴细胞受抗原刺激后增殖分化成浆细胞，可以产生相应的抗体。 动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。 每一个淋巴细胞只能产生一种抗体，产生什么抗体要看遇到什么抗原。,传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？ 怎样解决这个问题？,单克隆抗体,由接触过抗原的单个B
16、淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点： 特异性强、灵敏度高、可大量制备,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,如何筛选？,融合方式？,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,思考：,1、本过程利用了哪些原理？,免疫、细胞融合和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,应用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计
