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1、苯丙氨酸氨解酶基因 在大肠杆菌 BL21DE3中的表达,苯丙氨酸氨解酶简介,缩写PAL。是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。EC4315。是1961年JKoukol，EConn在大麦中发现的。存在于高等植物、酵母、菌类的可溶性部分。推测分子量为30万。这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。在很多情况下，其反应成为酚类化合物合成的有步骤的速率阶段。在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照，病伤害，植物激素处理等会使活性显著增加。另外有时还受光敏色素所支配。在多数情况下，在组织中活性增加的同时，酶发生失活作用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为，这种失活是
2、与类蛋白质物质作用有关。此外也已指出有非活性的酶的存在。,预期目标,遗传性缺乏苯丙氨酸羟化酶所致的苯丙酮尿症是人类常见的先天性苯丙氨酸代谢缺陷病，是引起先天性智力降低的主要原因之一。为防止痴呆的发生，在出生后至发育期必需服用不含或含极少量苯丙氨酸的合成食物，费用十分昂贵。用酶在肠道内/外将消化后的苯丙氨酸降解，是一个有希望的取代途径。,预期目标,苯丙氨酸氨解酶(L-phenylalanine ammonia lyase, PAL)广泛分布于植物和某些真菌中，它可使苯丙氨酸降解为无毒的苯丙烯酸。在动物实验中证明，口服该酶可降低实验性苯丙酮尿症动物血清中异常增高的苯丙氨酸浓度，已有学者研究将该酶固
3、化后，口服用于治疗苯丙酮尿症。尽管PAL在临床治疗应用中具有良好的前景，但无法从真菌和高等植物细胞中大量提取PAL，为此，试图应用基因工程技术探索从大肠杆菌中获取大量廉价的PAL，藉以通过口服在肠道内消除苯丙氨酸，或用于生产廉价的无苯丙氨酸食物，达到治疗苯丙酮尿症的目的。,获取工程菌的过程,目的基因的获取,获取工程菌的过程,二、重组子的制备及酶切分析： rPAL-1-cDNA大小为2519 bp，pET-28c大小为5367 bp，通过T4 DNA连接酶连接后的重组表达质粒应为7886 bp。挑取四个重组阳性克隆，经EcoR I酶切图谱鉴定，所得片段符合预计大小（见图2，lane2, 4, 6
4、, 8）。由于应用单酶切插入目的基因所获得的重组质粒，存在着正反两种插入方向。为了获得所需的正向插入重组克隆，经查阅GenBank, 在对rPAL-1-cDNA及pET-28c质粒的酶切图谱分析后，选用各自都只有一个酶切位点并能显著区分正反插入方向的BamH I进行酶切鉴定。根据理论分析，经BamH I酶切后可能出现的二种情况如下：正向插入生成的二个片段大小预计应为337bp和7549 bp，反向插入分别为2194 bp和5692 bp（见图3）。四个重组克隆的BamH I酶切图谱见图2，lane 1, 3, 5, 7。由此可知，获得了3个正向插入重组克隆和1个反向插入重组克隆。,获取工程菌的
5、过程,三、重组质粒测序： 重组表达质粒测序结果如图4所示，与设计时预期的完全相同。说明该重组质粒已正向插入目的基因，对阅读框架分析，完全肯定了该质粒能正确表达rPAL-1-cDNA。,获取工程菌的过程,重组子的转化 按文献，将质粒pUC19-rPAL-1-cDNA转化大肠杆菌DH5，并加以扩增。根据文献在水稻苯丙氨酸氨解酶基因（GenBank/EMBL, Accession number: x16099）ATG下游131-112碱基段设计测序引物5 TGGATCTTGACCAGCGGCT 3，对pUC19-rPAL-1-cDNA质粒进行反向测序。测序按Perkin Elmer公司推荐的BigD
6、ye标记终止碱基双脱氧法在ABI PrismTM310自动序列分析仪上进行。根据测序结果，在表达质粒pET-28系列中，选择与之相匹配的表达载体。,获取工程菌的过程,筛选与鉴定 用EcoR I酶将pET-28c从多克隆位点处切开，在其5端用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）脱去磷酸，纯化后溶于双蒸水中备用。 用EcoR I酶切质粒pUC19-rPAL-1-cDNA，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（80V 4 h），切取2.5kb的rPAL-1-cDNA条带，用透析袋法回收，经酚、氯仿抽提，乙醇沉淀纯化，溶于双蒸水。 按文献描述步骤用T4DNA连接酶将2.5kb rPAL-1-cDNA与5端脱磷酸之线性
7、pET-28c连接重组成表达质粒，连接时取插入片段DNA与pET-28c DNA的摩尔比为31。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21DE3, 在含有卡那霉素的LB平板上,筛选出阳性克隆。,获取工程菌的过程,根据rPAL-1-cDNA及pET-28c酶切图谱，选用BamH I酶切重组质粒，鉴定插入方向。并用测序引物对重组质粒PET-28c-rPAL-1-cDNA进行测序，进一步确定其插入方向及阅读框架。,获取工程菌的过程,工程菌的诱导表达及SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析： 挑取正向插入克隆，接种于含50 g/mL卡那霉素的LB培养基中，37振荡培养16 h,以1200比例接种于新鲜的含抗生素的培养基
8、中, 37振荡培养2.5 h进行扩增,取100 mL菌液作为诱导前对照。然后加入终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)，在37振荡培养中诱导工程菌表达,分别于诱导1,3,5,7 h四时间点取样,以BL21DE3及经pET-28c空载体转化的BL21DE3为对照，在超声裂解液中将大肠杆菌超声破碎，200 W 10 s，停10 s，重复10次。4 15 000 r/min离心15 min，上清液和沉淀分别进行10% SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，200 V，30 min，考马斯亮兰染色，结果经Kodak digital scienceTM电泳扫描仪分析确定其
9、分子量及蛋白表达量。,结果,表达质粒pET-28系列的选择： 应用测序引物对质粒pUC19-rPAL-1-cDNA进行部分测序，结果见图1。从rPAL-1-cDNA序列中首先找出翻译起始密码ATG，根据3个碱基编码1个氨基酸的原则，由此往上推算可知，要求表达载体在EcoR I接头处的三联体结构必需具备与之相匹配的ATT框架。对比大肠杆菌表达质粒pET-28a, b, c部分序列，发现在重组后，能保持正确阅读框架，而不发生移码的只有pET-28c符合要求。若rPAL-1-cDNA正向插入pET-28c 多克隆位点上的EcoR I位点，预期重组后的表达质粒部分序列应如图1所示。,获取工程菌的过程,
10、10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及扫描分析： 以大肠杆菌BL21DE3和经pET-28c质粒转化的BL21DE3为对照，与经pET-28c-rPAL-1-cDNA 转化的BL21DE3在同等条件下按照方法六项中描述的方法进行扩增、诱导表达、裂解和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果如图5。工程菌在分子量66.2 kD和97.4 kD间，出现明显的表达条带，表达的目的蛋白主要存在于沉淀中（以包涵体形式存在），而对照组BL21DE3及经pET-28c质粒转化的BL21DE3都没有出现。IPTG诱导5和7 h时蛋白表达量最高，表达产物His-rPAL的分子量为78.6 kD，与文献报导一致。IPT
11、G诱导1,3,5,7 h蛋白表达量占菌体总蛋白量的百分数分别为21.40%, 30.60%, 35.40%, 35.43%。,获取工程菌的过程,结果分析,在BL21DE3宿主菌中，它既能应用异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)使lac阻遏蛋白失活，从而使T7启动子脱阻遏并诱导T7聚合酶，提高表达目的基因水平，同时，由于宿主菌不表达OmpT和Lon蛋白酶，因此表达产物又比较稳定，不会被宿主菌蛋白水解酶所降解。我们建株的工程菌，经超声破碎后的粗提物，按Zucker建立的苯丙氨酸氨解酶活性测定方法，测得的酶比活性为461.7 nmol.g-1.min-1。该质粒还具有表达His6-Tag结构，便于应用Ni柱亲和层析，快速纯化，经凝血酶酶切，有可能获得具有活性的天然PAL。为今后PAL的基础研究（如高等植物中的UV反应，创伤防御，氧化应激，凋亡等）及临床治疗（如苯丙酮尿症）奠定了基础。,
