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1、生物物理学 （Biophysics),生物物理学是由物理学与生物学相互结合而形成的一门交叉学科。 它应用物理学的基本理论、方法与技术研究生命物质的物理性质，生命活动的物理与物理化学规律，以及物理因素对机体的作用。,生物物理学发展简史,1892年，Karl Pearson, 科学的方法,20世纪中期，近代生物物理学诞生 （50年代X射线衍射对蛋白质测定的应用）,生物物理学的内容,分子生物物理学（Molecular Biophysics),生物物理仪器与技术( Biophysical Instrumentation and Techniques),膜与细胞生物物理学(Membrane and Ce
2、ll Biophysics),理论生物物理学(Theoretical Biophysics),感官与神经生物物理学( Sensory and Neural Biophysics),荧光分光光度,Spectrophotofluorimetry,一、荧光的发现 二、荧光与荧光光谱 三、荧光光谱仪及主要谱参量 四、荧光生色团的结构特点 五、影响荧光测量的因素 六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用,荧光分光光度技术,一 荧光的发现,1575：N.Monardes Lignum Nephriticum,1852：Stokes 分光计 植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、 奎宁,1880：Liebeman
3、最早提出“荧光与化学结构关系”, 的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序幕,借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演,荧光 Fluorescence,（一） 荧光的产生 （二）荧光光谱与吸收光谱,二 荧光与荧光光谱,（一） 荧光的产生,1 分子的能量状态,在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er Ee：价电子运动能, electron Ev：原子在平衡位置附近的振动,vibration Er：分子绕其重心的转动能, rotation 其中，Ee Ev Er,（一） 荧光的产生,2 分子的能级Energy Levels与跃迁Transition,（二）荧光光谱与吸收光谱
4、,荧光分光光度术： 又称荧光光谱术，属于光谱技术中的一种发射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。激发波段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。,（一）荧光光谱仪 （二）荧光分光光度术中的参量,三 荧光光谱仪与主要参量,（一）荧光光谱仪,（二）荧光分光光度术中的参量,exMaximum excitation wavelength em, max Maximum emission wavelength,瑞利峰 拉曼峰,A 荧光强度的定义：在一定激发波长(ex)作用下，发射的 荧光强弱。 F=Ia Ia=I0-I，I=I010-cL F =
5、 I0(1-10-cL ) 当C很低时F= I0cL ， 当C较大时F=I0 B =发射光子数/吸收光子数,2 荧光强度（fluorescence intensity, F, I ）与 量子产率（quantum yield, ）,（二）荧光分光光度术中的参量,荧光强度与浓度的关系,32,荧光偏振( fluorescence polarization),（二）荧光分光光度术中的参量,自然光 部分偏振光 偏振光,荧光偏振度Fluorescence polarization -p 荧光各向异性Fluorescence anisotropy - A,(1) 荧光偏振度的物理意义： A ：I/=I ，P
6、=0，自然光，荧光分子运动很快，取 向随机。（稀溶液） B：I/或I为0 ，P=1 偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。 C： I/I 0 ，0P1，生物大分子的荧光属于这种情况。,43,(2) 仪器校正因子G,G= IHV/IHH V(vertical）, H(horizontal),(3) 环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响,A .温度的影响：,溶液粘度,A：温度的影响 温度升高，P降低 B：溶液粘度 粘度升高，P升高 C：分子的运动转动,旋转弛豫时间rotational relaxation time ,（二）荧光分光光度术中的参量,4 荧光寿命 （Fluorescence lifti
7、me -） 荧光衰减为原来的1/e所需要的时间 I=I0e-kt , =1/k 5 荧光探剂 (1) 具有环状共轭双键即电子系统 (2) 量子产率随环境变化，而且变化很大 (3) 能产生稳定荧光的小分子 藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein 与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价 结合,四 荧光生色团的结构特点,1 天然荧光生色团的结构特点,（1）碳原子骨架： 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。,（2）分子的几何排布： 具有刚
8、性平面结构,荧光素,酚酞,四 荧光生色团的结构特点,（4）取代基的位置： 邻位、对位荧光增强，间位荧光减弱（-CN基例 外） (5)环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影响荧光,四 荧光生色团的结构特点,（3）取代基的类型： （1）加强荧光的基团：给电子取代基， -NH2, -NHR, -OH,-OR, -CN,-OCH3,-OC2H5 （2）减弱荧光的基团：得电子取代基， -CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I （3）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH3,2 蛋白质和核酸中的荧光生色团,Tryptophan (W, Trp),
9、Phenylalanine (F, Phe),Tyrosine (Y, Tyr),四 荧光生色团的结构特点,亚硝基奈酚+Tyr 茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Phe,ex:460nm, em:570nm,ex:365nm, em:515nm,四 荧光生色团的结构特点,41,五 影响荧光测量的因素,1 光化分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂荧光减弱 2 淬灭(quenching) 温度淬灭：温度系数；温度升高淬灭增多 浓度淬灭： 20 内滤光效应（inner filter effect) (3)杂质淬灭：3O2 1O2 3 溶剂的极性和pH 极性降低 荧光蓝移 D
10、PH: 440nm-430nm 强度 100倍 四环素 PH 7 荧光最强 PH 7 荧光很弱,六 荧光分光光度术的应用,1.物质的检测 1）测量原理： 稀溶液， F= I0cL 2）结构特点：含有“芳香环”结构 3）灵敏度：10-710-8g/ml,2.蛋白质的内源荧光,研究生物大分子构象,3.蛋白质的荧光标记,4 核酸的荧光标记,5 酶反应动力学的研究,乳酸盐+ NAD+ 丙酮酸盐+ NADH+H+,乳酸脱氢酶,NADH ：em=450nm ex=340nm,用杀鼠灵滴定HSA,Scatchard图,6 生物大分子的结合研究,r,=,L,Ka (n - r),L = L0 LP = L0
11、rP0,ex=320nm em=400nm,7 大分子内基团间或分子间距离的测定,荧光共振能量转移,( Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET),荧光共振能量转移的三个条件：,供体和受体都能发光 供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠 供体和受体的距离必须小于100 31,7 大分子内基团间或分子间距离的测定,Forster 公式,E= R06/(R6+R06),R0: 临界距离，E：转移效率，R：基团间距离,E= 1- IDA/ID IDA: 受体存在时的荧光强度，ID：受体不存在时的荧光强度,7 大分子内基团间或分子间距离的测定,(1)膜
12、流动性 DPH ：P值小，流动性高 2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高 (2) 膜渗漏性 羧基荧光素( selfquenching) (3) 膜电位的测量 花菁（cyanine) : 超极化时，荧光强度F下降。 缬氨霉素：K+载体 Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+) KO+：细胞外浓度， KI+：细胞内浓度,8 膜生物物理研究,23,(4)膜融合机理的研究,1/2,（5）膜成分扩散速度的测定,荧光漂白恢复技术 fluorescence recovery after photobleaching，FRAP,D：扩散系数，：光斑半径， 1/2：漂白后的荧光值恢复到稳
13、定值的一半 所需时间， rD：与光斑形状有关的一个常数。,常用探剂：标记脂类DiI 标记蛋白异硫氰荧光素（FITC），蕊香红（rhodamine）,D=,2,41/2,rD,9 荧光技术与其它技术的结合,(1）显微荧光光度术 对细胞内的不同成分进行定性定位或定量 （2）流式细胞术 荧光，激光和计算机结合 （3）激光扫描共聚焦显微镜 FRAP （4）光镊（optical tweezers),Fluo-3/Ca2+，AM, ex=506nm, em=526nm,七 思考题 1 荧光产生的机理是什么？ 2 荧光技术研究的生物学样品的主要参数有哪些？量子产率与荧光强度的区别及关系是什么？ 荧光偏振的意
14、义是什么？ 3 举例说明荧光技术的应用？,4.如果婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为酪氨酸的酶时，则苯丙氨酸的含量异常增大而患“苯丙酮尿症”且易引起智力低下，所以，对婴幼儿的该项体查极为重要，但是，由于血液蛋白质中其它芳香氨基酸的影响而难以测出苯丙氨酸的含量，请用本课程所学内容提出一个检测方案。,参考资料,1.赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版 社，海德堡：施普林格出版社，2000 2.林克椿，生物物理技术波谱技术及其在生物学中的应用，北京：高等教育出版社，1989 3.林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。北京大学医学出版社，2004 4.李楠，王凤翔，周春喜，荧光探针应用技术，北京：军事医学科学出版社，1998 5.Pattabhi Vasantha, Gautham N. Biophysics, Pangbourne: Alpha Science, c2002. ,
