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1、体外分析技术,核医学科,体外分析技术,利用放射分析或非放射分析技术测定生物样品中微量生物活性物质含量的一类分析法。 体外放射分析技术 放射性竞争结合分析:放射免疫分析（RIA) 放射性非竞争结合分析:免疫放射分析（IRMA) 受体放射配基结合分析(RBA),体外非放射分析技术 化学发光分析 时间分辨荧光分析 酶免疫分析,放射免疫分析 （Radioimmunoassay,RIA）,概念,是利用特异抗体与标记抗原和非标记抗原的竞争结合反应，通过测定复合物放射性来计算非标记抗原的量的一种超微量分析技术。 1959年Berson和Yalow 首先报导人体血浆内源性胰岛素的免疫分析。 1977年荣获诺贝
2、尔奖。,原 理,基本原理是竞争结合反应 *Ag+Ab *AgAb+*Ag (free) + Ag AgAb + Ag (free),+,+,+,+,6,8,X100=75%,X100=50%,X100=25%,X100=12.5%,8,4,8,2,8,1,0 2 4 8 16 32 64 128,80 70 60 50 40 30 20 10,B/F,Ag,*Ag和Ag与Ab具有相同的结合能力，当Ab的量有限时，相互竞争，相互抑制。 Ag和*Ag与Ab结合的量取决于两者的浓度比。遵循质量作用定律。 *Ag与Ab的结合率随着Ag的量的增加而减少，呈负相关。反之亦然。,原理,将结合型B (AgAb
3、和*AgAb)与游离型F (Ag和*Ag)分离开，分别测定其放射性，则B/F与Ka和待测Ag呈函数关系。 用已知的不同浓度的标准Ag与一定量的*Ag和Ab作用，即可测得在各种标准浓度下的B/F比值，以此绘成标准曲线。 根据被测Ag的B/F比值，就可在标准曲线上求出相应的该抗原的含量。,原理,Ag+Ab AgAb 反应达到平衡时 Ka= = K1为Ag与Ab结合速率常数 K2为Ag与Ab解离速率常数 Ka为平衡常数或亲和力常数,K1,K2,K1,K2,AgAb,AgAb,数学模式,数学模式,若Ag0及Ab0分别代表抗原及抗体的初始浓度，则平衡时： Ag=Ag0-AgAb Ab=Ab0-AgAb
4、B/F= AgAb/Ag (B/F)2+(1+KaAg0-KaAb0)B/F-KaAg0=0 Ka为常数， Ab0为固定值， Ag0=*Ag+Ag， *Ag为设定的量。 B/F与未标记Ag之间呈函数关系。,基本方法:主要试剂,特异抗体 高亲和力(affinity): Ag与Ab结合的能力。 高特异性(specificity): 不易发生交叉反应。 高滴度(titer):所需抗体量少,杂质干扰少。 标记抗原 1)与待测物同一物质; 2)生物活性不变; 3)核素半衰期长; 4)高比活度、放化纯度。 标准品（非标记抗原）,结合与游离部分的分离,快速而完全分离。 操作简便，来源容易，价格便宜。 不受血
5、清、外界条件及其它试剂的干扰。 适用于任何容积的反应液。 非特异结合率小。,常用液相分离技术: 收集抗原抗体复合物（B）,双抗体沉淀法: 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但 成本高. 聚乙二醇(PEG)沉淀法: 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法,常用液相分离技术： 收集游离抗原(F),活性炭吸附法: 吸附游离部分，适用于分离小分子游离抗原。 快速、简便、准确性差. 葡聚糖包被活性炭(DCC) 增强吸附和减少解离，常使用。 活性炭联结氧化铁制备DCC. 微孔滤膜过滤法 盐析法、层析法、电泳法,常用液相分离技术: 固相法,固相分离法 按材料（塑料、纤维
6、素、凝胶颗粒）不同，有试管法、微粒法等。 固相分离法是RIA近年来发展较快的领域 试管固相法：抗体吸附在塑料试管上 吸附量小，重现性差等 微粒法和微球法：吸附量大等。,基本步骤,加样：系列反应管中加入相同剂量的* Ag、Ab，不同剂量标准Ag或一定量样品。 孵育：反应达到平衡所需孵育时间温度不同。 分离结合及游离部分： 测放射性：125I、3H 数据处理：以B/F为纵坐标，标准Ag浓度为横坐标，制作标准曲线。通过标准曲线求出待测样品的浓度。,放免分析的优点,灵敏度高 特异性强 精确度高,缺点,同位素的半衰期短，试剂盒不宜较长时间储存。 125I标记抗原,辐射自分解影响标记物的稳定性，时间过长标
7、记物可脱碘和变性。 放射性涨落引起样本的计数误差。 反应时间长，难以做到快速和自动化检测。 废物处理带来许多不便。,质量控制（quality control，QC),对分析工作的误差进行经常性的检查，遇有质量异常及时采取对策，以保证分析误差控制在可接受的范围内。 实验室内部质控 系统误差：某一系统变化，整批样品受影响。 随机误差：随机现象，只对某一管或某一样品影响。 实验室间质控：地区性或全国性对各实验室结果比较,免疫放射分析 (Immunoradiometric assay,IRMA),原理,Ag+Ab*=Ag*Ab+*Ab (free) 过量的*Ab与Ag结合形成Ag*Ab复合物，通过免疫
8、吸附剂除去游离*Ab。 Ag*Ab复合物的放射性与Ag的量成正相关。 非竞争结合反应。 应用过量*Ab，能测定低浓度Ag，灵敏度提高。,基本方法,夹心法：被测配体中加入固相抗体，再加标记抗体，形成Ab1-Ag-Ab2复合物，用洗涤去除未结合的游离*Ab。测定复合物的放射性活度能代表被测配体的量 。,标记第三抗体法:标记第一抗体的抗体，如羊抗兔或兔抗鼠IgG，通过与一抗相结合而测定其结合放射性活度，如夹心法为Ab1-Ag-Ab2-*Ab3四复和物，称此*Ab3为通用试剂 方法学上的进一步改进:生物素-亲和素系统(bio-avidin system,BSA)的引入，对提高灵敏度及缩短分析时间有较明
9、显的效果。,特点,易于标记：标记物为抗体，结构相同，125I 标记方便 反应速度快:非竞争结合反应，标记抗体过量，易达平衡 灵敏度高：无不确定因素，灵敏度提高10100倍。 工作范围宽： 特异性高：单克隆抗体 精密度好：加样误差主要来自抗原一个环节,缺点,至少两株抗体：主要限于肽类和蛋白质，很多小分子半抗原不能应用。 缓冲液PH及离子强度要求严格。 应用 CEA、AFP、铁蛋白、HbsAg、ACTH、PHA、胰岛素、FSH，TSH、降钙素、血管紧张素I& II 、抗血友病因子、凝血VIII因子等 。,IRA与IRMA的区别,反应类型 结合类型 标记物 待测物 RIA 免疫反应 竞争结合 抗原
10、抗原 IRMA 免疫反应 非竞争 抗体 抗原,受体放射配基结合分析 （ Radioligand binding assay,RBA）,受体特性,受体(receptor, R)是蛋白质，是细胞蛋白组分。 配体(ligand, L)是与受体特异结合的物质。 R与L具有极高的识别能力和高度亲和力。 R与L结合可触发相应的生理反应或药理效应。 具有饱和性、可逆性及符合质量作用定律。,R + *L R*L 受体与配基的结合反应 非竞争性的结合反应 核素标记配基 分析受体的数量和性质,原理,根据R*L的放射性和*L的比活度推算受体数量 利用Scatchard作图法求出受体的亲和力常数，反映受体的性质。 通
11、过测定类似物或阻断剂竞争受体的能力可测定其特性。,饱和曲线,Scatchard作图,RT,RT KD,1 KD,离体RBA基本方法,制备标本(亚细胞组分、细胞悬液、冰冻切片） 加样（放射配基、缓冲液、标本、非标记配基） 孵育（反应达平衡） 分离结合和游离的放射配基 测量结合部分的放射性 数据处理或观察切片上的受体分布,放射配基的要求,高比活度：受体数量低 高亲和力：易达饱和、易分离 高特异性：减少交叉反应 高放射化学纯度：参数计算依据配基用量和 比活度，大于95% 结合与游离部分分离 低温和快速分离。过滤、离心、透析、电泳等 常用过滤法:玻璃纤维滤膜,总结,反应类型 结合类型 标记物 待测物
12、RIA 免疫反应 竞争结合 抗原 抗原 IRMA 免疫反应 非竞争 抗体 抗原 RBA 受体配体 非竞争 配基 受体 数量和性质,非放射性标记免疫分析,提高灵敏度 减少放射性废物 原理相同 探测信号不同 探测仪器不同,一、酶标记免疫分析 (enzyme immunoassay, EIA),EIA和 IEMA（酶免疫分析法）的测定原理与RIA和IRMA相同，竞争结合和非竞争结合。 IEMA应用最多-酶联免疫吸附分析(ELISA)。 只是用酶替代标记抗原或抗体的放射性核素 常用的酶辣根过氧化酶(HRP),底物四甲基联苯胺(TMB) 分光光度计检测,二、化学发光免疫分析,化学发光免疫分析（Chemi
13、luminescence Immunoassay CLIA） 标记物为能产生化学发光的化合物，如异鲁米娜、甲基氮蒽。碱性条件下遇过氧化物有单光子发射。缺点:发光时间短。 化学发光酶免疫分析(ECLEA) 标记物碱性磷酸酶，底物金刚烷。可靠性高。 电化学发光免疫分析(ECLIA) 电解反应与化学发光结合。标记物三丙胺，底物三价钌化合物。可循环利用、发光时间长、强度高易测定等。,二、荧光标记免疫分析,以荧光物质标记抗体，与相应抗原结合后，在荧光酶检测仪中测定其强度，从而进行抗原（或抗体）定位及其分布或测定体液或标本中抗原的含量。,分类 传统荧光免疫分析FIA 时间分辨荧光免疫分析(TrFIA) 标记物为镧系元素，常用铕(Eu)。经紫外光激发后发出荧光。灵敏度高，可重复测定；增强剂有毒性。,非同位素免疫分析,优点： 无放射污染 自动化 试剂货架时间长 缺点： 价格贵 仪器不易质控,谢谢！,
