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1、多原核胚胎在辅助生殖技术中的研究进展,报告人：林彭思远 2012-1-10,多原核受精卵染色体组成 多原核胚胎发育及遗传多态性分析 多原核胚胎的移植价值 选择性显微移除多原核受精卵中多余原核以维持其二倍性,体外生殖技术中多原核胚胎较为常见，且存在遗传物质倍性的改变，可能会导致多倍体胚胎的出现，因此临床上多原核受精卵均被遗弃，不用于移植。 IVF-3PN约占5%8.1%，ICSI-3PN约占2.5%6.2%。,多精受精（IVF-3PN） 卵母细胞过熟或不成熟、受精时精子浓度过高、手术取卵过程造成卵母细胞透明带损伤或先天透明带缺损 女方年龄和穿刺卵泡数与成熟卵的多原核受精卵生成率呈负相关 精液a+
2、b级精子密度与未成熟卵多原核受精卵生成率呈正相关 第二极体未排出（ICSI-3PN） 多了一个雌原核的三原核受精卵 有报道指出ICSI后的3PN可能是由于严重少弱精患者的双倍体精子产生的。从临床立场来看 ，严重少弱精患者在ICSI后有更高获得三倍体胚胎的可能。 Egozcue S,Blanco J,Vidal F,et al. Egozcue1 Diploid sperm and the origin of triploidy.Hum Reprod,2002,17(1):5-7.,2009-重庆医科大学有学者对人类异常受精卵及胚胎染色体组成做过相关研究，共收集IVF来源3PN受精卵及胚胎323
3、枚。含秋水仙素培养基中培养14-20h后去除透明带、低渗、梯度固定常规收获染色体。 受精卵 三倍体75.7% 2细胞胚胎 三倍体70.8% 2细胞胚胎 三倍体9.3%，近单倍体（32%），近二倍体（56%） IVF-3PN受精卵及2细胞胚胎多为三倍体，2细胞胚胎多为近二倍体、近单倍体，但染色体核型紊乱,染色体组成,2005-汉城国际大学医学生殖研究所有学者采用4,13,18,21，X and Y六色荧光FISH检测三原核受精卵染色体组成。 收集常规IVF-3PN胚胎32枚， 50%为非嵌合的，纯三倍体7枚，纯二倍体7枚，纯单倍体2枚。 三-二倍体嵌合1枚，二-单倍体嵌合9枚，单倍体嵌合4枚，常
4、染色体非整倍性2枚（三倍体）。 高比例的嵌合是多原核胚胎发育停滞的重要原因,染色体组成,遗传多态性分析,2009-广州市生殖与遗传重点实验室对IVF和ICSI中多原核受精卵的发育及其遗传多态性进行了研究。 分别收集IVF和ICSI治疗中多原核受精卵315个和67个，进行体外培养，观察比较其发育能力， 并复合扩增2个囊胚细胞DNA和多原核来源的1株胚胎干细胞的15个短串联重复序列（STR）基因座，分析其STR多态性。 13个CODIS基因座、D2S338、D19S433 （DNA联合检索系统，所含遗传信息与疾病无关，与遗传体质无关，仅用于个体识别） 胚胎干细胞为小鼠胚胎成纤维细胞传代培养建立的I
5、VF治疗来源的3PN胚胎干细胞系。,结果： 受精卵卵裂率 胚胎停育率 囊胚形成率 IVF 96.8% 10.2% 8.8% ICSI 91.0% 39.3% 32.4% 无显著性差异 显著差异 显著差异 IVF组和ICSI组多原核受精卵卵裂率无显著差异，但IVF组胚胎停育率和囊胚形成率显著低于ICSI组。 ICSI过程中对卵母细胞的机械损伤，使细胞骨架结构异常，导致染色体分裂紊乱，致使发育停滞。 多原核胚胎自身基因的缺陷是导致胚胎停育的原因。 克服了4-细胞阻滞期后的ICSI来源多原核受精卵有更好的发育能力，所获得的囊胚在遗传学研究方面更有价值。,遗传多态性分析,三个基本等高 的多态性峰,三原
6、核受精卵来源胚胎干细胞的15个STR基因座多态性分析 一个表现为三个基因登高的多态性峰，其余多为峰面积比例接近2:1的多态性峰，该胚胎为三倍体核型,ICSI-4PN受精卵发育成的囊胚 15个STR基因座均为1个或2个等面积多态性峰，二倍体核型,ICSI-4PN受精卵发育成的囊胚 15个STR基因座均为1个或2个等面积多态性峰，二倍体核型,STR基因座多态性检测显示，IVF组3PN受精卵来源的胚胎干细胞为典型的三倍体特征，但ICSI组受精卵来源的2个囊胚未表现多倍体特征。 高比例二倍体多原核受精卵的存在表明, ICSI 治疗中3PN受精卵可能因第2极体(Pb2)没有排出或注射了二倍体精子所致,
7、也可能因ICSI操作损坏卵母细胞骨架、纺锤体形成错误导致染色体不能正确分离, 形成一些分散的染色体片段, 从而错误形成多个原核。 甚至有人提出在患者ICSI后无2PN胚胎时，可考虑利用遗传学诊断技术选择正常核型的3PN胚胎进行移植。但其在临床应用中的安全性还有待进一步研究。,有研究显示，用FISH技术检测ICSI-3PN受精卵，其中36%为二倍体。 Grossmann M, Calafell JM, Brandy N, et al. Origin of tripronucleate zygotes after intracytoplasmic sperm injection. Hum Repr
8、od, 1997, 12(12):2762-5.,移植价值,应用X/Y双色探针荧光原位杂交对多原核受精卵进行非整倍体率检测 三倍率(%) 二倍率(%) 单倍率(%) IVF-3PN受精卵 36枚 92.31 3.85 3.85 ICSI-3PN受精卵 32枚 70.83 25 4.17,相对于IVF后的卵子来说，ICSI后的3PN卵子有显著增高的二倍体率。 取卵较少的患者行ICSI后，如果3PN的卵子占大多数时，对其形成的胚胎行植入前遗传学诊断（PGD）是必要也是可行的，可以选择正常的整倍体核型胚胎进行移植，从而得到正常的妊娠。,Kattera S, Chen C. Normal birth
9、after microsurgical enucleation of tripronuclear human zygotes: case report. Hum Reprod 2003;18:131922.,IVF-3PN： XXX、XXY、XYY，三种核型之间无显著差异 ICSI-3PN： XXX、XXY，无XYY核型 说明在ICSI后的3PN中，多余原核可能是来自于第二极体，而不是精子。,选择性显微移除3PN受精卵中的1个原核以维持其二倍性,在常规IVF治疗中，大部分患者正常受精卵已可以满足需要，有生殖中心统计过每年有超过700例三原核受精卵的出现，其中还有一些是只有一两个卵的患者。选择性
10、移除多余原核以维持胚胎二倍性，获得可移植的胚胎可以为这些患者带来福音。 需注意的问题 1、多余原核的识别 2、两个中心体 3、ICSI后异常原核形成,Bernd E,Rosenbusch,Ph.D. Selective microsurgical removal of a pronucleus from tripronuclear human oocytes to restore diploidy:disregarded but valuable? Fertility and Sterility Volume 92, Issue 3 , Pages 897-903, September 200
11、9.,雌、雄原核的识别,观察是否有精子尾部残留物的存在 仅有约1%的原核可观察到精子残留物的存在 体积较大的为雄原核 距第二极体较近的为雌原核 多采用此种方法鉴别雌、雄原核，在双雄原核的3PN中移除距PB2较远的雄原核，在双雌原核的受精卵中移除距PB2较近的雌原核。,A：正常受精卵 B：双雄原核受精卵 双精子受精，存在两个中心体，引起细胞分裂紊乱。多由3PN受精卵直接分裂成三个细胞，此种胚胎严重异常，呈非三倍性染色体分布。而移除多余原核后此种分裂方式并未得到改善。因此在吸取原核时应多吸取一些周围的卵浆，期望将中心体一并吸出。 C：双雌原核受精卵 第二极体没有排除导致形成了一个多余的原核，胚胎只
12、含有一个中心体。,原核、中心体在配子细胞生成中的分布,A：第二极体没有排出，与初级卵母细胞染色单体不等分离，形成两个非整倍体雌原核 B：第二极体排出，初级卵母细胞自身不等分裂形成两个非整倍体雌原核 C：第二极体排出，但未含有23条染色单体，而是残留了一部分在胞浆内形成了一个非整倍体雌原核。,ICSI-3PN可能的细胞异常分裂情况,文献研究,通过对多原核受精卵中雌、雄原核的形态的研究，距极体较远原核来源的分析及移除原核后胚胎的存活率及发育潜力的研究来探讨选择性移除多余原核获得可移植胚胎的可行性。 其中Escriba等(2006)还通过FISH及多态性位点分析胚胎遗传物质的亲缘关系。移除多余原核后
13、存活的二倍体胚胎全部进行了卵裂，其中96%（49of51）发育到了6-cell和8-cell阶段，41%（21of51）发育到了囊胚阶段。,受精卵3-104枚（共269枚），且多为IVF中双精受精导致的3PN。 其中共有81例采用了细胞松弛素类物质。有研究表明细胞松弛素类可以抑制肌动蛋白多聚化，在显微操作中降低对细胞骨架的机械损伤，提高胚胎存活率。 但细胞松弛类物质具有细胞毒性，可能引起细胞裂解、延缓卵裂、发育停滞、导致纺锤体不稳定等。 细胞松弛素类在显微操作中并不是必要的。,人类三原核胚胎的自我校正,收集ICSI-3PN胚胎32枚和IVF-3PN胚胎18枚 体外培养至第6天的胚胎通过FISH
14、进行染色体整倍性的检测， 对发育至囊胚的胚胎通过13、18、21、X和Y五色荧光FISH进行染色体整倍性的检测， 其中二倍体囊胚及其父母再通过6、16、X染色体上STR位点扩增检测其遗传物质亲源性。,Noelia G,Laura E,Julio M, et al. Self-correction in tripronucleated human embryos.ertility and Sterility. Vol. 96, No. 4, October 2011.,ICSI-3PN染色体整倍性检测,IVF-3PN染色体整倍性检测,卵裂阶段，ICSI-3PN比IVF-3PN有更高的二倍体形成率
15、，二者差异显著。 多原核胚胎卵裂阶段的分析提示自我校正胚胎数由其原核来源决定（IVF or ICSI）。 双雌原核受精卵的第二次减数分裂中胞质的异常分裂会导致第二极体未排出，引起母源遗传物质残留。母源原核可以由同源染色单体中的任一单倍体形成。受精后第一次细胞分裂中，母源单倍型将会加倍，而父源的单倍型可以维持有丝分裂的正常形式。因此可以假定ICSI-3PN受精卵全基因组自我校正的机制将在合子阶段被触发。,囊胚形成率：20/32（62.5%）,囊胚形成率：8/18（44.4%）,D16S3395、D16S475、D16S3024三个位点的STR扩增图谱，胚胎遗传物质呈二倍体，一个单体型遗传自父方，
16、一个单体型遗传自母方。 4个二倍体ICSI-3PN囊胚均遗传了父源和母源的遗传物质,IVF-3PN胚胎在发育早期自我校正能力较差，主要是由于多为双精受精，多余原核为雄原核，胞质中存在两个中心体，引起第一次有丝分裂染色体分布紊乱，使胚胎发育停滞。 IVF-3PN中只有一枚经过自我校正形成二倍体的囊胚，未做遗传物质的亲缘关系检测，考虑该胚胎为双雌原核的3PN受精卵发育而成，此种胚胎是由于卵巢超刺激作用产生的较为少见的形式，为异常胚胎，在常规IVF中是不用于移植的。 IVF-3PN胚胎中，自我校正最早在发育至第6天的胚胎中发生，提示选择性显微移除其多余原核以维持二倍性在IVF-3PN受精卵中是有必要的。,结论,ICSI-3PN胚胎比IVF-3PN胚
