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1、有机酸发酵工业进展,报告内容,一. 有机酸发酵工业概况 二.中国有机酸发酵工业现状及成就 三. 中国有机酸发酵研究进展举例 丙酸发酵 -酮戊二酸发酵 四. 中国有机酸发酵工业展望,一、有机酸发酵工业概况,有机酸概述,有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸，其酸性源于羧基 (-COOH),Various substances that can be derived from succinic acid by chemical conversion.,Trends in Biotechnology , 2008:100 - 108,有机酸概述,有机酸也是重要的平台化合物,Rene
2、wable raw materials,全球有机酸的产量超过300万吨、产值超过50亿美元,柠檬酸,乳酸,苹果酸,葡萄糖酸,醋酸,衣康酸,曲酸,丙酮酸,酒石酸,丙酸,C2,C3,C4,C5,C6,丙烯酸,富马酸,酒石酸,有机酸发酵概况,二、中国有机酸发酵工业现状及成就,中国有机酸发酵工业现状,有机酸工业是发酵工业领域一个成熟的分支。 2012年中国有机酸的总产量超过200万吨。,柠檬酸,乳酸,苹果酸,葡萄糖酸,醋酸,衣康酸,曲酸,丙酮酸,食品和饮料,医药工业,化学工业,建筑业,例如：酸味剂,例如：抗凝血剂,例如：洗涤剂,例如：混泥土,日照鲁信金禾生化有限公司,安徽丰原集团,河南金丹乳酸科技股份
3、有限公司,潍坊英轩实业有限公司,山东柠檬生化有限公司,宜兴协联生物化学有限公司,杭州宝晶生物化工有限公司,青岛科海生物有限公司,天富生化技术有限责任公司,西王集团,主要生产企业,产品,应用领域,沈阳科纳提克公司,酒石酸,其他工业,例如：显影剂,琥珀酸,安徽雪郎生物科技股份有限公司,丙酸,中国有机酸发酵工业成就,(1) 自主创新能力显著增强,研发投入加大：企业研发投入约占销售收入的3-5%。,研究平台,衣康酸：2000年获国家科技进步二等奖。,长链二元酸：2006年获国家科技进步二等奖。,丙酮酸：2006年获国家科技进步二等奖。,L-乳酸：2011年获国家科技进步二等奖。,“丙酮酸发酵技术”被世
4、界上最大发酵公司之一日本味之素公司购买，成为该公司从中国购买的第一个技术。,中国有机酸发酵工业成就,(2) 产品产量迅速提高、产品结构更趋合理,近20年，我国有机酸发酵工业主要产品的总产量呈快速增长的态势。产品品种从早期2-3个发展到10余个。,近20年有机酸主要产品产量,单位：万吨,中国有机酸发酵工业成就,(3) 生产技术水平不断上升（以柠檬酸为例）,有机酸行业龙头近年来纷纷通过扩大优势产品的产能，提高抗风险能力，使得行业产业集中度呈现逐步提高态势，规模经济效应也使行业平均期间费用率呈现下降的趋势，这有利于保障行业的盈利能力提升与长期发展。,中国有机酸发酵工业成就,(4) 企业规模扩大，产业
5、集中度增强,我国有机酸发酵行业产业集中度,中国有机酸发酵工业成就,(5)新技术、新材料和新装备得到广泛应用,酶技术、膜技术和计算机技术越来越多的被采用,设备趋于大型化、连续化和自动化,三. 中国有机酸发酵研究进展丙酸,丙酸的应用及市场,2012: 260m lbs (117,936 tonnes),化学法：2万/吨,发酵法：6万/吨（食品安全）,丙酸钙价格,06年全球产量37.7万吨,75%用于谷物 和饲料防腐,筛选丙酸高产菌,菌种鉴定,筛选野生型质粒,细胞壁裂解条件优化,条件: 溶菌酶 20 mg/mL 37 oC, 蛋白酶K 2 mg/mL 56 oC. “-” 表示细胞壁没有裂解. “+
6、” 表示细胞壁被裂解.,质粒电泳图,质粒鉴定分析,质粒ORF转录水平分析,丙酸高产菌、野生质粒的筛选以及质粒分析,丙酸杆菌代谢工程改造策略,过量表达甘油脱氢酶（gldA），提高对甘油的利用速率 过量表达苹果酸脱氢酶（mdh），富马酸水合酶（fumC），提高丙酸代谢途径通量,gldA,mdh,fumC,过量表达甘油脱氢酶,野生菌与工程菌分批发酵对比 : 丙酸(PA), : 甘油浓度, : 细胞干重(DCW), : 乙酸(AA), : 琥珀酸 (SA), : 甘油脱氢酶比酶活.,培养基及培养条件优化,不同种类的碳源对丙酸发酵过程的影响,不同种类的氮源对丙酸发酵过程的影响,酵母粉浓度对发酵过程的影响
7、,PA,DCW,PA,DCW,SA,最佳碳源为20 g/L甘油，最佳氮源为酵母粉，最适浓度为10 g/L。 最佳接种量为10%，最佳接种龄为48-60h左右种子，最佳培养温度为30 。,MgSO4 7H2O (mg/L),DCW(g/L),SA (g/L),PA (g/L),金属Mg2+对发酵过程影响,金属Co2+对发酵过程影响,ZnSO4 7H2O (mg/L),金属Zn2+对发酵过程影响,金属Mn2+对发酵过程影响,培养基及培养条件优化-金属离子,最佳Co2+浓度为10 mg/L,发酵模式研究-分批发酵,分批发酵过程中，随着甘油浓度的增加，菌体比生长速率及丙酸的比合成速率显著下降，说明较高
8、的甘油浓度不利于菌体生长及丙酸的合成。,发酵模式研究-分批发酵,不同甘油浓度下过程动力学参数比较,随着初始甘油浓度的增加，发酵时间明显延长，生产强度显著下降；菌体干重先升高后降低；初始甘油浓度在20 g/L50 g/L时适合菌体生长。,仅通过分批发酵难以实现丙酸 发酵高产量、高得率和高生产强度的统一,发酵模式研究-流加发酵,注：A 初始甘油浓度为20 g/L，48 h-96 h恒速流加浓度为400 g/L的甘油水溶液，流速控制为0.01 L/h；B 初始甘油浓度为30 g/L，72 h-120 h恒速流加浓度为400 g/L的甘油水溶液，流速控制为0.01 L/h；C 初始甘油浓度为50 g/
9、L，在96 h时一次性添加质量为80 g的纯甘油；D 初始甘油浓度为40 g/L，在84 h一次性添加160g纯甘油； residual glycerol, PA, DCW, SA, * AA,不同流加发酵模式下过程动力学参数比较,发酵模式研究-流加发酵,最佳流加策略：初始甘油为30g/L，72-120h进行 恒速流加，流加速率为0.11L/h(甘油浓度为400 g/L),发酵模式研究- 10m3发酵罐放大试验,丙酸10 m3罐中试发酵过程曲线, residual glycerol, PA, DCW, SA, * AA,丙酸最高产量为47.28 g/L，生产强度为0.197 gL-1h-1 全
10、球第二家采用发酵法生产丙酸,三. 中国有机酸发酵研究进展-酮戊二酸, -酮戊二酸的应用,降低病患机体损耗,清除自由基，延缓衰老,提高繁殖率，促进骨骼的生长,有机中间体,体格增强剂、运动饮料添加剂,医药,化妆品,食品,化工,饲料, -酮戊二酸市场概况,国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量约为1万吨,化学法,发酵法,筛选得到的菌种：解脂亚诺酵母, -酮戊二酸的生产方法,生产效率低、环境非友好和有毒试剂使用，限制其在医药、保健品和食品等高附加值产品生产应用,生产效率高 环境友好 食品安全性高,食品安全级生物法生产-酮戊二酸,土壤样品,维生素B1缺陷型筛选,500株微生物菌株,0.1 g/L 13.4
11、%,0.1-1 g/L 74.4%,1-10 g/L 6.4%,10 g/L 5.8%,菌落形态,AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAA
12、CAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG,18S rRNA,Yarrowia lipolytica WSH-Z06,生物法生产-酮戊二酸的关键问题,当以甘油为唯一碳源时，发酵6天后-KG产量可达30 g/L左右，但是发酵
13、液中同时会积累大量的副产物丙酮酸(30 g/L左右)。,Y. lipolytica WSH-Z06摇瓶发酵曲线 -KG (), Glycerol (), Pyruvate (), DCW (),存在的问题,1.辅因子调控,3.节流,2.开源,4.调控转运蛋白,解决方案代谢工程改造解脂亚洛酵母,代谢工程改造解脂亚洛酵母,1.辅因子调控,调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累,过量表达ACS1基因使胞内ACS比酶活达到0.92 U/mg protein，过量表达ACL基因使胞内ACL酶活达到了1.51 U/mg protein，比对照分别提高了10.5和11.6倍，胞内乙酰辅酶A含量分别是对照的2
14、31.2% 和244.2%。,调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累,过量表达ACS1和ACL基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响,: -KG; : Glycerol; : pyruvate; : DCW,(A): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-CON; (B): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ACS1; (C): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ACL.,提高16.2%,提高28.6%,
15、Y. lipolytica-ACS1和Y. lipolytica-ACL中-酮戊二酸的产量分别为42.2 g/L和46.7 g/L，比对照菌(36.3 g/L)分别提高了16.2%和28.6%。丙酮酸产量分别为14.5g/L和10.6 g/L，比对照菌(21.2 g/L)分别降低了31.6%和50%。,代谢工程改造解脂亚洛酵母,2.开源,强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累,6.5倍,10.2倍,表达载体p0(hph)-ScPYC1和 p0(hph)-RoPYC2的构建,Y. lipolytica及其突变株胞内PC 酶活,转化子提取基因组进行PCR验证,强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累
16、,过量表达ScPYC1和RoPYC2基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响,: -KG; : Glycerol; : Pyruvate; : DCW,(A): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-CON; (B): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ScPYC1; (C): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-RoPYC2.,Y. lipolytica-ScPYC1和Y. lipolytica-RoPYC2中-酮戊二酸的产量分别为45.2 g/L和49.1 g/L，比对照菌(36.3 g/L)分别
