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1、1,第四章 微生物的生长与控制,微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映 生长繁殖情况可以作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标 生产实践中的各种应用、对致病微生物和霉腐微生物的防治与其生长繁殖和抑制密切相关,2,本章内容,测定生长繁殖的方法 微生物的生长规律 影响微生物生长的主要因素 微生物培养法 有害微生物的控制,3,三 微生物的连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。 连续培养（continuous culture） ：在
2、微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。,4,连续发酵（continuous fermentation）,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。 优点： 高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制； 产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电负荷均衡合理。 缺点：菌种易于退化；易
3、于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。 连续发酵生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,5,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。 （一）计数法 直接法（血球计数板） 间接法（平板计数法、膜过滤法、比浊法） （二）生长量法 直接法(干重法) 间接法（碳、氮含量法，其它生理指标）,第三节 测定生长繁殖的方法,6,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如真菌孢子、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不
4、易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,1.直接计数法血球计数板,7,2.间接计数法,8,（1）稀释平板计数法,9,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15-20min完成操作），严格无菌操作； 注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度； 适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物， 误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,A standard plate count (viable count
5、) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.,10,（2）薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后
6、计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,11,（3）比浊法,原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与吸光度成正比，菌数越多，吸光度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的吸光度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,12,二、生长量法,13,1、干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%-20%，而一个细菌细胞一般重约10-12-10-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时
7、，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,14,2.生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,15,微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用:一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响,另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改变环境.研究环境因素与微生物之
8、间的关系,可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面,同时防止它有害的一面.,第三节 环境因素对微生物的影响,影响微生物生长的外界因素很多，除了前面讲过的营养因素之外，还有许多物理化学条件。 本节主要内容： 一、温度对微生物生长的影响 二、氧气对微生物生长的影响 三、pH值对微生物生长的影响,16,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。 温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。 影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响物质的溶解度，对生长有
9、影响。,一、温度对微生物生长的影响,17,从微生物整体来看: 生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为-30 ，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物： 只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。 超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。 超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,（一）微生物生长的三个温度基点,18,1、高温对微生物的影响 高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。,（三）高温与低温对微生物的影响,19,
10、当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。 低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。 当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。,2、低温对微生物的影响,20,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌 好氧菌 微好氧菌 兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌 厌氧菌 (专性)厌氧菌,二、氧气对微生物生长的影响,21,专性好氧菌（str
11、ict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性厌氧菌（facultative aerobe）,22,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活
12、不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,23,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。 在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O
13、2）、超氧阴离子（ O2 ）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。 好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等， 而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,24,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶,25,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。 培养好氧微生物：需震荡
14、或通气，保证充足的氧气。 培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化还原电位势。 培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,26,三、pH值与微生物生长的相互影响,27,微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同,（二) 不同微生物对pH要求不同,28,一些微生物生长的pH值范围,29,同一种微生物在其不同的生长阶段和不
15、同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要， 举例：Aspergillus niger(黑曲霉)在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,30,微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。 这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。,31,微生物的生命活动对环
16、境pH值的影响,微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因： 由于有机物分解： 分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降； 分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升,32,微生物的生命活动对环境pH值的影响,培养过程中调节pH值的措施 过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。 过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。,配制培养基时调整pH值的措施,33,第五节 微生物生长繁殖的控制,34,几个基本概念,灭菌（sterilization） 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。 消毒（disinfection） 采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。 防腐（antisepsis） 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。 化疗（chem
