微生物的遗传变异和育种_7

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1、第八章 微生物的遗传变异和育种,第一节 遗传和变异的物质基础 第二节 基因突变和诱变育种 第三节 基因重组 第四节 基因工程 第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,返回主目录,遗传型又称基因型，指某一生物体所含有的全部遗传因子即基因的总和。 表型- 指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 变异生物体在某种内因或外因的作用下，所引起的遗传物质结构或数量的变化。变异的特点在群体出现的速率极低（10-5-10-10），变化后的新性状可遗传。 饰变不涉及遗传物质结构变化，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,表型饰变：,表型的差异只与环境有关，其特点： 暂时性、

2、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,第一节 遗传和变异的物质基础

3、 一. 3个经典实验 1、1944年，Avery精确重复了转化实验， 确定了转化因子,实验证明:将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,第八章微生物的遗传变异和育种,返回目录,2、噬菌体感染实验,实验证明：进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完 整噬菌体的全部信息。,第八章微生物的遗传变异和育种,3、植物病毒重建实验1956年H.Frankel-conrat用TMV 的RNA和HRV（霍氏车前花叶病毒）RNA进行重组，说明核酸是遗传物质。,第八章微生物的遗传变异和育种,二. 遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 （一）遗传物质在7个水平上的形式 1、细胞水平 （真 原） 2、细胞核水

4、平（基因组） 3、染色体水平（单双） 4、核酸水平(种类结构大小) 5、基因水平 （操纵子） 6、密码子水平（三联体） 7、核苷酸水平,第八章微生物的遗传变异和育种,（二）微生物基因组结构的特点,1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）； 2）基因组上遗传信息具有连续性； 基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短； 个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA 中也发现有

5、内含子或间插序列,第八章微生物的遗传变异和育种,1）典型的真核染色体结构； 啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布 在16条染色体中； 2）没有明显的操纵子结构； 3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列； 4）重复序列多；,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,第八章微生物的遗传变异和育种,（三）原核生物的质粒,1、定义 质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进 行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,第八章微生物的遗传变异和育种,2、结构特点 通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；

6、也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb； （细菌质粒多在10kb以内）,第八章微生物的遗传变异和育种,3、质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数 松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid) （只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host range plasmid) （可以在许多种细菌中复制）,第八章微生物的遗传变异和育种,4、质粒在基因工程中的应用

7、 质粒的优点： （1）体积小，易分离和操作 （2）环状，稳定 （3）独立复制 （4）拷贝数多 （5）存在标记位点，易筛选,E. coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体,第八章微生物的遗传变异和育种,6、质粒的主要种类,质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应,致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（cryptic plasmid）,

8、第二节基因突变和诱变育种,一. 基因突变生物体内遗传物质的分子结构，突然发生了可遗传的变化。几率10-6-10-9 (一).基因突变 营养缺陷型 基因突变而丧失合成一种或几种生 长因子的能力类型。 选择性突变 抗性突变型 产生对某种药物或物理因子的抗性 类型 条件致死突变型某种条件可生长，另一种条件死 的类型。 形态突变性 个体或菌落形态所发生的非选择变 化的类型。 非选择性突变 抗原突变型指基因突变引起的抗原结构发生 突变的变异类型。（L型细菌） 产量突变型 指基因突变而获得的在有用代 谢产物产量上高于原始菌株的突 变株。,(二)突变率10-6-10-9,第八章微生物的遗传变异和育种,返回目

9、录,(三).突变的特点,.不对应性指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。因这一突变有的可自发或其他诱变因子诱发获得。 .自发性 变量实验: 1943年S.E. Luria 等又称波动实验 涂布实验: 1949 Newcombe设计 平板培养法。 平板影印实验: 1952证明微生物的抗药性在未接触 药物前就产生了，这一突变与药物毫无关系：产生28 个突变株。 .稀有性 一般在10-6-10-9 .诱变性 可提高10 10 5 .稳定性 遗传结构发生了稳定性的变化。,4.基因突变的机制,转换 碱基置换 点突变 颠换 移码突变 缺失 诱变 缺失 添加 添加 突变 崎变 易位 倒位 自发突变

10、,.独立性 在某一群体中，即可发生抗青霉素，又可发生抗链霉素的突变型。 .可逆性 野生型基因 突变型基因,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明,第八章微生物的遗传变异和育种,1.碱基的置换 碱基的置换属于一种染色体的微小损伤，也称点突变。分为转换（嘌呤换嘌呤，嘧啶换嘧啶）A-G；颠换（嘌呤换嘧啶或）A-T。 直接引起置换的诱变剂，直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，如亚硝酸、羟胺、各种烷化剂。 间接引起置换的诱变剂，通过活细胞的代谢活动渗入到DNA分子中后引起的，如嘌呤、嘧啶及5-BU. 2.移码突变指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的添加（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部

11、遗传密码发生转录和转译错误。吖啶类染料，包括亚啶黄。亚啶橙（诱变机制还不清楚）。,转座因子(transposible element),跳跃基因(jumping gene)在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。,(3)染色体畸变,插入序列(insertion sequence)：分子量小，0.71.4kb，只能引起转座效应而不含其它任何基因。,转座子(Tn, transposon)：分子量为225kb，含有几个到十几个基因。能插到受体DNA分子的许多位点上。,Mu噬菌体(mutator phage)：是E. Coli的一种温和噬菌体，分子量大，约37kb，含20多个基因，可以

12、引起插入突变。,自发突变的机制,1.背景辐射和环境因素 实质上是一些原因不详的低剂量诱变因 素长期综合诱变作用的结果辐射或高温。 2.微生物自身有害代谢物的诱变效应，如 自己产生过氧化氢的作用。 3.互变异构效应酮式至烯醇式的互变效 应引起5-BU。 4.环出效应DNA复制过程中链上产生 小环。,1 损伤机理,2 修复,光复活作用：把近紫外线照射的微生物立即暴露于可见光下，可显著降低其死亡率。 暗修复作用：切除修复，有四种酶参与。,5 紫外线对DNA的损伤及修复,二. 突变与育种,1. 自发突变与育种 . 从生产中选育 .定向培育优良品种用某一 特定因素长期处理某些微生物的群体，同时不断的对他

13、们进行移种传代，选择相应的自发突变菌株。传统的方法。卡介苗（结核分支杆菌）的培育，法国科学家A.Calmette 和C.Guerin把牛型结核分支杆菌接种了230代，前后13年，获得了显著减毒的卡介苗。 梯度平板法筛选（P-220） 2. 诱变育种 . 基本环节可以慨括为由少数到高效（P213）,. 诱变育种应考虑的原则：,（1）选择简便有效的诱变剂： 化学诱变剂种类很多（P214），N-甲基- N、硝基-N-亚硝基胍（NTG），诱变效果显著。 NTG处理许多菌种，可得到1280%的营养缺陷型，又称为超诱变剂，而一般的诱变剂处理只得到几%，拟辐射（有些烷化剂既能诱发点突变，又能诱发只有辐射才能

14、诱发的染色体畸变）。任何能改变核酸结构的因素都可能引起核酸生物学功能的改变。三致 “致变(正负) 致畸 致癌”,70 年代发明微生物利用营养物质缺陷的回变检出致癌物艾姆斯试验。艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸缺陷型his-菌株在基本培养基的平板上不能生长，如果发生回复突变则能生长。,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高.,平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂； 有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高； 在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。 该法广泛用于监测

15、食品饮料药物等试样中的致 癌物时间3天，准确率85%。,化学诱变方法（较为简单的一种）： 先在平板表面涂一层出发菌株细胞，然后在平板上放几棵很小的诱变颗粒，或含诱变剂的滤纸片，在菌圈的边缘挑取突变菌落，分别制成悬乳液，稀释涂抹接种，最后用影印培养法或逐个检出法选出突变株。 物理诱变剂： 紫外线、其它射线。 常用的物理诱变方法： 紫外线诱变15w灯，30厘米，时间不短于15秒，不长于10-20分，将5毫升单细胞悬液，放置在6厘米的培养皿中在无盖条件下照射。,（2）挑选优良的出发菌株 最好是经过选育过的自发变异株。 （3）处理单孢子（或单细胞）、均匀悬液 尽管如此还会出现不纯的菌落，称为表型延迟。

16、因为诱变剂只作用于DNA一条连，故某一突变无法反映在当代表型上，对霉菌放线菌处理孢子，对芽孢杆菌处理芽孢。 （4）选用最适剂量 目前采用杀菌率为7075%，甚至3070% （5）充分利用复合处理的协同效应 同一诱变剂的重复使用、两种混合或多种先后使用、同时使用等 （6）利用和创造形态、生理和产量间的相关指标P217。 一般分为初筛和复筛两种方案。,3. 营养缺陷型突变菌株的筛选,.培养基的选择 基本培养基（MM）仅能满足某微生物 野生型营养菌株生长的 最低组分培养。 完全培养基（CM）凡可满足一切营养 缺陷型菌株营养需要的 天然或半合成培养基， 称为完全培养基。 补充培养基（SM）凡只能满足相应营 养缺陷型菌株营养需要 组合培养基，称为