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1、挥发性盐基氮检测作业指导书【微量扩散法】1. 目的为规范肉类新鲜度检测岗位操作和确保检测结果的准确性和一致性。2. 适用范围本手册适用于化验员对肉类TVB-N的测定。3. 职责检验人员负责对肉类TVB-N的检测，并根据检验结果进行判定。4. 工作程序4.1. 原理肉类TVBN原理：挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。挥发性含氮物质可在 37 碱性溶液（饱和碳酸钾溶液）中释出，挥发后吸收于吸收液（2%硼酸）中，用标准酸滴定，计算含量。4.2. 使用试剂4.2.1. 饱和碳酸钾溶液称取50g碳酸钾，加 50mL 水，搅拌助溶、过滤
2、，使用上清液。4.2.2. 水溶性胶称取 10g 阿拉伯胶，加 10mL 水，再加 5mL 甘油及 5g无水碳酸钠（或无水碳酸钾），研匀。 4.2.3. 硼酸吸收液硼酸(20g/L)溶液。 用精确到0.01g的电子天平准确称取1.00g的硼酸,用50 mL的移液管准确移取50 mL的蒸馏水,配制成20g/L的硼酸溶液. 4.2.4. 盐酸 c(HCL)=0.001mol/L 的标准滴定溶液。参照GB/T601-2002 A. 基准试剂（无水Na2CO3）称取在270300高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水Na2CO3: 5.4g加入500 mol的容量瓶中,加入蒸馏水定容,配成0.1 mol
3、/L的Na2CO3溶液;再取10 ml浓度为0.1 mol/L Na2CO3溶液至1000 ml的容量瓶中, 加入蒸馏水定容,配制成0.001 mol/L碳酸钠溶液,待用.B. 0.001 mol/L的盐酸溶液的配制取36%的盐酸8.4mL至100mL的容量瓶中,加入蒸馏水定容,配成约0.1 mol/L的盐酸。再取10ml浓度为0.1 mol/L mol的盐酸至1000 ml的容量瓶，加入蒸馏水定容，配制成约0.001 mol/L的盐酸溶液。C. 溴甲酚绿-二甲基红的配制:即3体积0.1%的溴甲酚绿乙醇溶液与1体积0.2%的甲基红乙醇溶液混合。 a.0.1%的溴甲酚绿乙醇溶液配制称取0.10g
4、溴甲酚绿，溶于乙醇，用乙醇稀释至100ml即可。 b.0.2%的甲基红乙醇溶液配制称取0.20g甲基红，溶于乙醇，用乙醇稀释至100ml即可。 c.溴甲酚绿-二甲基红将0.1%的溴甲酚绿乙醇溶液与0.2%的甲基红乙醇溶液按3：1的体积比混合摇匀即得溴甲酚绿甲基红混合指示剂。(GB/T 6032002)D. 0.001 mol/盐酸的标定用10ml移液管吸取10ml0.001 mol/L碳酸钠溶液,加入10滴溴甲酚绿-二甲基红,用0.001 mol/L的盐酸溶液滴定至溶液颜色由绿色变成暗红色,煮沸2min冷却后继续滴定至溶液成暗红色,读出所用0.001 mol/L的盐酸的体积数.计算出盐酸的mo
5、l浓度.标定前颜色 标定后颜色4.2.5. 2g/l甲基红乙醇溶液称取0.2克甲基红，加入100ml分析纯乙醇，震荡均匀。4.2.6. 1g/l.次甲基蓝溶液称取0.1克次甲基蓝，加入100ml蒸馏水，震荡均匀。注:将4.2.5与4.2.6两种指示剂等量混合为混合指示剂。4.3. 仪器设备微量扩散皿微量滴定管：最小分度 0.01ml 。恒温培养箱4.4. 检验流程8加水和甘油研磨搅匀9在微量扩散皿外缘涂抹胶体11用1 ml吸管吸取1ml饱合K2CO31肉类品取样，暂存2样品处理，搅碎3称取10g样品放入250ml三角瓶内三角瓶内5将三角瓶放入震荡器振荡30min6将均质液过滤10用1ml吸管吸
6、取1ml样品滤液7称取阿拉伯数胶无水碳酸钠17加盖，摇匀18:361培养2h19滴定20计算21报告4将100ml蒸馏水放入三角瓶内摇匀12用1 ml吸管吸取1ml2%硼酸溶液13用1 ml吸管吸取1ml2%甲基红乙醇溶液14用1 ml吸管吸取1ml1%次甲基蓝溶液15摇匀混合混合16用滴管移取2至3滴混合操作步骤：4.4.1. 肉类品取样，暂存用洁净的刀取肉类表层2cm处，去皮和肉筋，用小胶袋包装好暂存在05冰箱内暂存。4.4.2. 样品处理，搅碎将肉取出，用刀或剪刀除去脂肪、骨、肌腱，绞碎搅匀,用绞肉机碎肉时注意安全。样品用刀或剪刀去除脂肪、骨、肌腱4.4.3. 称取10g样品放入250m
7、l三角瓶：用镊子将绞好的肉准确镊取10g，放入三角瓶。称量10g样品称量空三角瓶 4.4.4. 将100ml蒸馏水放入三角瓶内摇匀：用量筒准确量取100ml蒸馏水，先倒入约15ml蒸馏水入三角瓶，震荡，用玻璃棒搅拌，再放入剩余的蒸馏水后用锡箔纸封存好。加入100ml蒸馏水 4.4.5. 将三角瓶放入震荡器振荡：震荡30min。样品液振荡 4.4.6. 将均质液过滤：用滤纸将均质液过滤。待用。样品液过滤备用 4.4.7. 水溶性胶配制4.4.7.1. 称取阿拉伯树胶和无水碳酸钠：按一个样品需用三个扩散皿，每皿需用1克树胶、0.5克碳酸钠的量来称取阿拉伯树胶和无水碳酸钠.并记录药品使用记录表.4.
8、4.7.2. 加蒸馏水水和甘油研磨搅匀:按一个样品需用三个扩散皿,每皿需用0.5ml甘油和1ml蒸馏水的量来用移液管移取蒸馏水和甘油,并和阿拉伯树胶、无水碳酸钠一起研磨搅匀. 称量好的阿拉伯树胶、无水碳酸钠 无水碳酸钠与蒸馏水混合 加入阿拉伯树胶混合 加入甘油4.4.7.3. 在微量扩散皿外缘涂抹胶:用玻璃棒或药匙在微量扩散皿外边缘涂抹，注意手不能碰到微量扩散皿的内壁。 微量扩散皿外缘涂抹胶4.4.8. 样品处理4.4.8.1. 用1 ml吸管吸取1ml饱合K2CO3，放入扩散皿的外圈内. 扩散皿的外圈加入1mlK2CO3内 4.4.8.2. 用1ml吸管吸取1ml样品滤液，放入扩散皿的外圈内
9、，与饱合K2CO3相反的另一边。注意两液不能混合。扩散皿的外圈加入1ml样品液4.4.8.3. 用1 ml吸管吸取1ml2%硼酸溶液。加入扩散皿的内圈中。扩散皿的内圈加入1ml2%硼酸溶液4.4.8.4. 用1 ml吸管吸取1ml2%甲基红乙醇溶液，放入一个小广口瓶内。吸取1ml甲基红乙醇溶液，放入小广口瓶内。 4.4.8.5. 用1 ml吸管吸取1ml1%次甲基蓝溶液，与甲基红液同一小广口瓶内。1ml亚甲基蓝溶液与1ml甲基红乙醇溶液混合均匀。 4.4.8.6. 摇匀混合：将（13）和（14）两指示剂混合。4.4.8.7. 用滴管移取2至3滴，放入扩散皿的内圈中。移取2至3滴混合指示剂，放入
10、扩散皿的内圈中。 4.4.8.8. 加盖，摇匀。将上述药品混合后即加盖摇匀。注意力度不要太大，以免溶液溢出。同时需作平行试验和空白试验。(每个样品需做3个平行实验,两个空白试验) 空白试验只是皿外室一侧加样品浸抽液1 ml，改为加入无氨蒸馏水，其余操作不变。4.4.9. 培养在361培养箱内存放2小时。361培养箱内存放 4.4.10. 滴定培养箱里存放2h后取出,开启盖子(滴定时才能开盖),用0.001mol/L的盐酸小心滴定皿内室的吸收液至终点呈蓝紫色。用0.001mol/L的盐酸滴定至终点呈蓝紫色 4.4.11. 计算挥发性盐基氮（TVB-N,mg/100g）=(V1-V2)/(W*1/100)*14*100 式中 V1 样品所耗0.001mol/L盐酸标准溶液的量（mL） V2 空白所耗0.001mol/L盐酸标准溶液的量（mL） W 样品的重量 14 氮分子量 100 换成100克肉的挥发性盐基氮系数4.4.12. 报告4.4.12.1. 计算出的结果挥发性盐基氮,以毫克每百克（mg/100g）报告；4.4.12.2. 肉类挥发性盐基氮15mg/100g。5. 相关文件5.1. GB/T601-2002化学试剂 标准滴定溶液的制备5.2. GB5009.44-2003肉与肉制品卫生标准的分析方法6. 记录表格6.1. 药品使用记录表6.2. TVB-N检测原始记录表
