硕士生物仪器分析之紫外-可见光谱

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1、光谱和谱学分析 Spectroscopy and Spectral Analysis,Introduction,光是一种电磁辐射,从波长极短的宇宙射线至波长很长的无线电构成一个连续光谱。,Introduction,部分电磁辐射范围 远紫外 100200 nm 近紫外 200400 nm 可见光 400800 nm 近红外 8002500 nm 远红外 25003500 nm,Introduction,谱图范围的选择,决定了仪器采用的光学组件,紫外可见光谱,UV-Vis Spectrophotometer (UV-Vis),紫外线,紫外线是位于日光高能区的不可见光线(100-400 nm),紫外

2、线,根据生物效应的不同,将紫外线按照波长划分为四个波段 :,UVC波段(200275 nm) 短波灭菌紫外线; 穿透能力最弱,无法穿透大部分的透明玻璃及塑料; 对人体伤害很大,短时间照射即可灼伤皮肤; 长期或高强度照射还会造成皮肤癌; 紫外线杀菌灯。,UVD波段(100200 nm) 真空紫外线; 穿透能力极弱; 臭氧发生线。,紫外线,UVA波段(320400nm) 长波黑斑效应紫外线; 有很强的穿透力,可以穿透大部分透明的玻璃以及塑料; 可直达真皮层,破坏弹性纤维和胶原蛋白纤维,晒黑; 360 nm波长制作诱虫灯; 365 nm可用于矿石鉴定、舞台装饰、验钞等场所; 虾青素能有效消除UVA对

3、皮肤细胞的伤害 。,UVB波段(275320 nm) 中波红斑效应紫外线; 中等穿透力,波长较短的部分会被透明玻璃吸收; 能促进体内矿物质代谢和维生素D的形成; 长期或过量照射会令皮肤晒黑; 紫外线保健灯、植物生长灯。,优点: 消毒杀菌; 促进骨骼发育; 对血色有益; 偶尔可以治疗某些皮肤病; 紫外线照射直接影响人体维生素D的合成,紫外线的特点,缺点: 使皮肤老化产生皱纹 产生斑点 造成皮肤炎 造成皮肤癌 造成皮肤粗糙,紫外线的应用,化学:涂料固化,颜料固化,光刻,油烟氧化,光触酶 仪器分析:矿石,药物,食品分析 生物学:灭菌,促进植物生长,诱杀蚊虫,人体保健照射,UV-vis spectro

4、scopy is the measurement of the wavelength and intensity of absorption of near-ultraviolet and visible light by a sample.,Ultraviolet and visible light are energetic enough to promote outer electrons to higher energy levels.,The ultraviolet region falls in the range between 190-380 nm. The visible r

5、egion fall between 380-750 nm.,紫外-可见光谱,UV-vis spectroscopy is usually applied to molecules and inorganic ions or complexes in solution.,紫外-可见光谱,The uv-vis spectra have broad features that are of limited use for sample identification but are very useful for quantitative measurements.,分子从电子基态(S0)跃迁到电子

6、激发态(SE)的E远大于振动能级及转动能级的E。 电子跃迁所吸收的电磁波是吸收光谱中频率最高的,即紫外可见光。,分子的总能量是其键能(电子能)、振动能和转动能的总和,当分子从辐射的电磁波吸收能量之后,分子会从低能级跃迁到较高的能级。,基本原理,基本原理(Basic principle),多原子分子电子能级和跃迁类型,n *,有机化合物外层电子为: 键的电子; 键的电子; 未成键的孤电子对n电子;,吸收频率决定于分子的能级差,其计算式为: E = h 或 E = hC / 式中 E为分于跃迁前后能级差; 、分别为所吸收的电磁波的频率及波长; C为光速; h为普朗克常数。,基本原理(Basic p

7、rinciple),紫外吸收谱带的形状:较宽,分子吸收电磁波能量后,电子从基态 s0跃迁到激发态, 其同时伴随有振动能级的跃迁+转动能级的跃迁,稀薄气态,浓度增大,低极性溶剂,高极性溶剂,基本原理(Basic principle),The concentration of an analyte in solution can be determined by measuring the absorbance at some wavelength and applying the Beer-Lambert Law.,朗伯比尔定律,A=吸光度 I0=入射光强度 I=入射光通过样品后的透射强度 摩尔

8、吸光度(cm-1.m-1) C=摩尔浓度(mol) l=光程(cm),Molar absorptivities may be very large for strongly absorbing compounds ( 10,000) and very small if absorption is weak ( = 10 to 100).,朗伯比尔定律,UV/VIS spectroscopy in microplates (or 96 well),http:/ 乙腈 n-Hexane 正己烷 Isooctane 异辛烷 Cyclohexane 环己烷 95%乙醇 Methanol 甲醇 Ethy

9、l ether 乙醚 Dioxane 1,4-二氧六环 三甲基磷酸酯 Chloroform 氯仿,190 190 200 200 205 205 205 215 215 215 245,常用溶剂的透明界限,Solvent,Lower limit (nm)透明界限,溶剂的选择: (1) 端吸收 (2) 样品浓度 (3) 溶质和溶剂分子之间的作用力 (4) 溶剂的挥发性、稳定性、精制的再现性等。,生色团 (chromophore):产生紫外(或可见)吸收的不饱和基团,如CC、CO、NO2等。 助色团 (auxochrome):其本身是饱和基团(常含杂原子),它连到生色团时,能使后者吸收波长变长或吸

10、收强度增加(或同时两者兼有),如:OH、 NH2、Cl等。 深色位移 (bathochromic shift):由于基团取代或溶剂效应,最大吸收波长变长。深色位移亦称为红移(red shift)。 浅色位移 (hypsochromic shift):由于基团取代或溶剂效应,最大吸收波长变短。浅色位移亦称为蓝移(blue shift)。 增色效应 (hyperchromic effect):使吸收强度增加的效应。 减色效应 (hypochromic effect):使吸收强度减小的效应。,基本术语,基本原理(Basic principle),各类化合物的紫外吸收,1. 简单分子,A. 饱和的有机

11、化合物 a. 饱和的碳氢化合物 *跃迁,紫外吸收的波长很短。 b. 含杂原子的饱和化合物 杂原子一般为助色团,有n *跃迁。近紫外区仍无明显吸收。 硫醚、二硫化物、硫醇、胺、溴化物、碘化物在近紫外有弱吸收,但其大多数均不明显。 B. 含非共轭烯、炔基团的化合物 都含电子,可以发生*跃迁,其紫外吸收波长较 *为长,但乙烯吸收在165nm、乙炔吸收在173nm。因此,它们虽名为生色团,但若无助色团的作用,在近紫外区仍无吸收。 C. 含不饱和杂原子的化合物 *、 *属远紫外吸收, n *亦属远紫外吸收,不便检测, 但 n *跃迁在紫外区,可检测。吸收强度低,但吸收位置较佳,易于检测。因此,在紫外鉴定

12、中是不应忽视的。,各类化合物的紫外吸收,2. 含有共轭体系的分子,A. 共轭体系的形成使吸收移向长波方向 一般把共轭体系的吸收带称为K带 (源于德文konjugierte)。K带对近紫外吸收是重要的,因其出现在近紫外范围,且摩尔吸收系数也高,一般10000。,B. 共轭醛、酮紫外吸收(K带)的计算,各类化合物的紫外吸收,2. 含有共轭体系的分子,C. a, b不饱和酸、酯,各类化合物的紫外吸收,2. 含有共轭体系的分子,一些共轭羧酸的UV吸收: 化合物 实测值(104) 计算值 CH2=CHCO2H 200(1.0) CH3CH=CHCO2H 205(1.4) Ph=CHCO2H 220(1.

13、4) 222(2175) CH3 (CH=CH)2CO2H 254(2.5) 256(3018208) CH3 (CH=CH) 3CO2H 294(3.7) 286(6018208) CH3 (CH=CH)4CO2H 332(4.9) 316(9018208),各类化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯 苯环显示三个吸收带,它们均起源于苯环*的跃迁,如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色团在苯环上取代的衍生物 D. 生色团在苯环上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯环 F. 杂芳环化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,各类化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,

14、A. 苯 苯环显示三个吸收带,它们均起源于苯环*的跃迁,如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色团在苯环上取代的衍生物 D. 生色团在苯环上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯环 F. 杂芳环化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,各类化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯 苯环显示三个吸收带,它们均起源于苯环*的跃迁,如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色团在苯环上取代的衍生物 D. 生色团在苯环上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯环 F. 杂芳环化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,紫外谱图的解析, 化合物在220800nm内无紫外

15、吸收,说明该化合物是脂肪烃、脂环烃或它们的简单衍生物(氯化物、醇、醚、羧酸等),甚至可能是非共轭的烯。 220250nm内显示强的吸收(近10000或更大),即存在共轭的两个不饱和键(共轭二烯或a,b 不饱和醛、酮)。 250290nm内显示中等强度吸收,且常显示不同程度的精细结构,说明苯环或某些杂芳环的存在。 250350nm内显示中、低强度的吸收,说明碳基或共轭羰基的存在。 300nm以上的高强度吸收,说明该化合物具有较大的共轭体系。若高强度吸收具有明显的精细结构。说明稠环芳烃、稠环杂芳烃或其衍生物的存在。,提供有关该化合物的共轭体系或某些碳基等的存在的信息。,蓝移、红移、pH值影响,紫外可见分光光度仪,主机由光源(氘灯或钨灯)、单色器(或双色器)、样品室、检测系统、电机驱动、计算机接口、电源等部分组成。,http:/www.forestscience.unimelb.edu.au/cresw

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