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1、1环氧化酶-2VEGF 在非小细胞肺癌组织中的表达及意义【摘要】 目的:观察环氧化酶-2（COX-2） 、VEGF 在 NSCLC 及非肿瘤性病变肺组织中的表达，探讨其在 NSCLC 发生发展及肿瘤血管生成中的作用。方法:制作 71 例 NSCLC 和 21 例非肿瘤性病变肺组织共 92 例的组织芯片，采用免疫组化技术检测 COX-2、VEGF 的表达。结果:COX-2、VEGF 在 NSCLC 组织中的阳性表达率分别为 77.47%、77.06%，均显著高于非肿瘤性病变肺组织（14.29%，38.10%） 。COX-2 的表达与肺癌组织的病理类型有关;VEGF 的表达与肿瘤大小、淋巴结转移与
2、否有关。NSCLC 组织中 COX-2 与 VEGF 表达具有相关性。结论:COX-2 和VEGF 在 NSCLC 的发生、发展、转移过程中发挥调控作用，可作为判断 NSCLC 转移和预后的重要生物学指标。COX-2 可能通过调节 VEGF 的表达参与 NSCLC 组织中血管生成。 【关键词】 非小细胞肺癌;COX-2;血管内皮细胞生长因子;组织芯片研究发现环氧化酶-2（COX-2）在多种肿瘤组织中高表达，并参与肿瘤血管形成，由 COX-2 催化合成的前列腺素可能作为血管生成剂促进肿瘤的形成。在人前列腺癌组织中发现 COX-2 与 VEGF 表达基本一致，而其增高幅度与肿瘤恶性程度相关 1 。
3、本研究旨在探讨 COX-2 与 VEGF 在人非小细胞肺癌组织中的表达、意义及相关性。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 研究对象:收集选择青岛市立医院胸外科 2004 年 1 月2005 年 10 月间手术切除非小细胞肺癌标本 73 例（术前均未行放、化疗）及肺良性疾病 21 例作为组织对照，所有标本均经病理检查证实并取自病变的典型区域。其中 NSCLC病理组织学诊断及分级采用 WHO1999 年肺癌组织学分类、分级标准 2 ，分期采用 1997 年国际抗癌联盟（UICC）制定的肺癌临床分期标准 3 。所有标本均及时经 10%中性福尔马林固定，熔点为 5658的石蜡包埋。1.1.2 研究材
4、料:鼠抗人 VEGF 单克隆抗体购自 Santa Cruz 公司，鼠抗人COX-2 单克隆抗体、PV9000 通用型免疫组化检测试剂盒、非免疫小鼠 IgG 均购自北京中杉公司。每批实验均分别取 COX-2、VEGF 阳性片作阳性对照，并分别用同种动物非免疫血清代替一抗作阴性对照。 1.2 方法1.2.1 组织芯片的制作:观察每一组织标本的 HE 切片以确定蜡块穿刺位置;用 Beecher Instru-ments 生产的组织芯片仪，从蜡块标记部位逐个取出 2mm 组织芯，随即推入受体蜡块上已打好的孔内，制作成组织芯片蜡块;将制作好的2组织芯片蜡块面向下置于模具中，60烤箱中放置 1h，使蜡块重
5、新熔为一体。随后将蜡块连同模具一同取出，静置自然冷却至室温，然后置于-4冰箱中7min，将蜡块与模具剥离;将制作好的组织芯片蜡块 3m4m 连续切片，冷水漂片，挑选组织芯完整的切片转移至 56水中展片，用预先制备好的 APES 载玻片捞片。1.2.2 组织芯片免疫组化标记:主要步骤为:组织芯片切片常规脱蜡至水;内源性过氧化物酶阻断;组织微波抗原修复;滴加适当稀释的一抗（其中COX-2:1600 稀释，VEGF:1300 稀释） ，湿盒内冰箱中 4过夜;分别滴加试剂 1、试剂 2，均在湿盒内 37孵育 20min;DAB 显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。 1.3 结果判定COX-2、VEGF
6、 免疫组化染色结果判断标准采用 Kim 4 阳性细胞半定量积分法:光镜下分析， 在排除非特异性染色的前提下，A 以切片中阳性细胞染色强度分级，0 级:阴性;1 级:弱阳性;2 级:中等强度阳性;3 级:强阳性。B 以切片中阳性细胞比例评分，染色的范围标记为 0（0） 、1（1%25%） 、2（26%50%） 、3（51%75%） 、4（76%100%）;两积分相加之和作为最后的染色积分，其积分2 认为阳性，其余均为阴性。 1.4 统计学分析应用 SPSS 软件包 11.5 进行数据处理，以 P0.05 确定差异有显著意义。2 结果2.1 组织芯片的质量本研究制成 2 个组织芯片蜡块，蜡块完整，
7、肉眼可见组织芯排列整齐，外形为圆形或类圆形，无缺损现象。芯片 HE 染色结果:点阵分布均匀，组织芯完整，只有 2 例组织芯缺失不全，1 例组织芯出现移位，为统计方便取有效例数 92 例（其中 NSCLC 组 71 例、对照组 21 例） ，有效率为 97.87%，仍可代表原样本信息，不影响统计学分析。71 例 NSCLC 病例中男性 53 例，女性18 例;年龄 38 岁81 岁，平均年龄 62.3 岁;鳞状细胞癌 38 例（高分化 1 例，中分化 22 例，低分化 15 例） ，腺癌 31 例（高分化 12 例，中分化 13 例，低分化 6例） ，巨细胞癌 2 例;发生淋巴结转移 33 例;
8、期 36 例，期 23 例，期 10 例，期 2 例。 2.2. COX-2、VEGF 在两组组织中的表达及其与 NSCLC 患者临床病理特征的关系 COX-2 蛋白阳性染色主要定位于胞浆，为清晰棕黄色弥漫性分布，强阳性组可见明显的颗粒状着色。COX-2 在 NSCLC 组织中的阳性表达率及与患者临床病理特征的关系见表 1、表 2。表 1 NSCLC、非肿瘤性病变肺组织中 COX-2、VEGF 的表达略表 2 NSCLC 中 COX-2、VEGF 的表达与临床病理特征的关系 （略）3VEGF 蛋白阳性染色主要定位于胞浆，呈棕黄色颗粒状，以肿瘤组织周边部位及坏死区域周围肿瘤细胞表达较强，肿瘤组织
9、内巨噬细胞、成纤维细胞及部分血管内皮细胞也呈阳性。VEGF 在 NSCLC 组织中阳性表达率及与患者临床病理特征的关系见表 1、表 2。2.3. NSCLC 组织中 COX-2 与 VEGF 的关系 （见表 3）表 3 COX-2 与 VEGF 在 NSCLC 组织中表达的相互关系略在 NSCLC 组织中 COX-2 表达阳性的 55 例组织中 VEGF 表达阳性的有 46 例（占 83.64%） ，而 COX-2 表达阴性的 16 例组织中 VEGF 表达阳性的仅有 8 例（占50.00%） ，经四格表 2 检验 COX-2 与 VEGF 表达密切相关（P0.05） 。3 讨论环氧化酶（CO
10、X）是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶，其中 COX-2 亚型为可诱生型，在正常生理状态下多数组织内检测不到，而在一定因素如生长因子、炎症介质、促癌剂及一些癌基因产物等刺激下表达增加。本实验应用组织芯片技术免疫组化染色检测 71 例 NSCLC 组织、21 例非肿瘤性病变组织中 COX-2 的表达水平，发现 COX-2 在 NSCLC 组织中阳性表达率为 77.46%，显著高于非肿瘤性病变组织。并在组织切片中观察到，NSCLC 组织中分布的部分增生腺体也可见COX-2 高表达，而在正常肺组织内的腺体少有表达，因此认为 COX-2 与肺癌的发生发展密切相关。目前国内外报道肺癌组织中 COX-2
11、 的表达与淋巴结转移及 TNM分期关系的结果尚不一致，虽然本实验中未发现 COX-2 的表达水平与淋巴结转移及 TNM 分期相关，但这并不足以否定其参与肺癌的浸润转移。Kozaki 等 5 用高转移肺癌细胞系实验显示，COX-2 表达与肿瘤侵袭转移能力呈正相关，其抑制物可减少肺转移，同时还观察到转移肺癌细胞内多种炎性介质及促血管生成物质增加，认为肺癌细胞可能在转移过程中利用 COX-2 参与炎症过程，类似炎症细胞穿越血管壁，从而促进肺癌血行转移。我们的研究中发现 COX-2 表达与淋巴结转移无关，但在肺腺癌组织中显著高表达，表明 COX-2 的高表达可能在肺腺癌的早期即已发挥促进癌细胞血行转移
12、的作用，而未参与淋巴转移途径，这与肺腺癌血行转移较早而淋巴转移较晚的临床特点相一致。血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前被认为诱导血管形成最重要的生长因子。VEGF 由许多肿瘤细胞释放，在原位肿瘤细胞中表达，特异地作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，介导血管形成。本实验 71 例 NSCLC 中 VEGF 阳性率为 76.06%，显著高于非肿瘤性病变组织，表明 VEGF 的表达与肺癌的发生有关。本实验结果显示 VEGF 表达仅与肿瘤大小、淋巴结转移具有相关性，在肿瘤直径大于 3cm 及淋巴结有转移的 NSCLC 组织中 VEGF 表达更显著，阳性率更高，表明 VEGF 与 NSCLC
13、的生长、转移有关。多项研究表明肿瘤细胞中 COX-2 的过度表达与新生血管的形成有关，在多种恶性肿瘤中 COX-2 和 VEGF 表达存在相关关系，而其增高幅度与肿瘤恶性程度相4关 1，6，7 。本实验结果也显示 COX-2 与 VEGF 存在相关性，提示 COX-2 可能通过调节 VEGF 的表达来促进非小细胞肺癌新生血管的形成。我们分析其中的机制可能有两方面，COX-2 催化花生四烯酸的代谢产物 PGE 2 、PGI 2 、TXA 2 等可直接促进血管内皮细胞的移位和生长因子诱导的血管形成 8 。增加促血管生成因子，如 VEGF 的表达。COX-2 催化产物前列腺素与相应受体结合，通过 c
14、AMP 和 cAMP 依赖蛋白激酶（PKA）途径诱导 VEGF 的表达 9 。Williams 等 10 将 Lewis 肺癌细胞植入 COX-2 基因缺乏的小鼠体内，观察到血管生成和肿瘤生长均受抑制，提示 COX-2 通过上调 VEGF 的表达从而促进血管生成。但 Tamura 等发现 VEGF 可以诱导人微血管内皮细胞 COX-2 和 PGE 2 的表达，且这种作用 可以被选择性 COX-2 抑制剂 NS398 抵消 11 。这些研究进一步支持 COX-2 和 VEGF 之间存在密切关系，但是两者之间究竟是何种正反馈机制有待于更深入的研究。【参考文献】1 Liu XH，Kirschenba
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16、 typing of lung and pleural tumors.3rd ed.Berlin:Springer-Verlag，1999:547.3 Mountain CF.Revisions in the international system for staging lung cancer.Chest，1997，111:17101717.4 Kim YB，Kim GE，Pyo HR，et al.Differential cyclooxygenase-2expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the uter-ine cervixJ.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，60（3）:822829.5 Kozaki K，Koshikawa K，Tatematsu Y，et al.M
