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1、基因工程 (Gene Engineering),授课老师：郭新红,生物学院,教材及参考书目,教 材 1.何水林主编.基因工程.科学出版社，2008. 参考书目 1.李立家，肖庚富基因工程2004. 2.吴乃虎. 基因工程原理(上下册). 科学出版社(第二版)，2002. 3.王关林. 植物基因工程. 科学出版社，2002. 4.王金发.分子生物学与基因工程习题集.科学出版社.2000. 5. J.萨姆布鲁克和 D.W. 拉塞尔著、黄培堂等译分子克隆实验指南1999年. 6. F Ausubel等著、颜子颖等译.精编分子生物学实验指南1998.,生物学院,绪 论,生物技术包括四大工程技术 基因工
2、程技术、细胞工程技术、蛋白质及酶工程技术、发酵工程技术 基因工程技术是生物技术的核心和关键，是主导技术 细胞工程技术是生物技术的基础 蛋白质及酶工程技术是生物技术的条件 发酵工程技术是生物技术获得最终产品的手段 生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞工程技术最为突出。,生物学院,一、基因（gene）,1. 基因生命的载体 基因是生物遗传信息的载体，它是由核苷酸序列(通常为DNA)组成的生物大分子，决定着生物的所有性状、行为和疾病的发生。,生物学院,基因工程理论依据 不同基因具有相同的物质基础 基因是可以切割的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的 基因通过复制
3、把遗传信息传给下代,生物学院,2. 基因是福音 发现了某疾病基因，就可以对患者进行基因水平上的治疗，从根本上根除疾病的危害。,3. 基因是企业家的聚宝盆 巨大的市场：基因工程药物 潜在的市场：肥胖基因（2000万美元）,生物学院,4.基因是铁的证据 基因分析在重大犯罪案件、历史案件的侦破中是最终确定罪犯的有力工具，当事人的头发、血、皮屑的基因分析都将作为确凿证据。,生物学院,基因工程的内容与应用,基因工程概念 基因工程(gene engineering):就是对不同生物的遗传物质，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要
4、的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。,又名遗传工程（Genetic Engineering) DNA重组技术(Recombinant DNA Techniques) 分子克隆（Molecular Cloning),生物学院,基因工程的内容与应用,基因工程最突出的优点 就是打破了常规育种难以突破的物种之间界限，可使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。 缩短了新物种出现的时间。,生物学院,基因工程研究的主要内容,基因工程的基本操作程序,生物学院,生物学院,基因工程一般操作步骤,1.从生物有机体基因组中，分离带有目的基因D
5、NA片段。,2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。,3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞并与之一起增殖。,生物学院,基因工程一般操作步骤,4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞,并筛选出已经得到扩增的目的基因。,5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。,基因操作的基本步骤,提取目的基因,目的基因与运载体结合,目的基因导入受体细胞,目的基因表达,分离出质粒并用限制酶进行切割,基因工程四大要素： 供体基因 载体 工具酶 受体细胞
6、 （细菌、植物和动物）,生物学院,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,一、基因工程诞生的理论基础 （一）理论上的三大发现 1.DNA是生物的遗传物质 （基因工程的先导）,1944年，美国微生物学家O.T.Avery首次证实遗传物质的基础是DNA，基因位于DNA上。,肺炎双球菌转化实验,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,35S标记蛋白质,32P标记 DNA,1952年Alfred Hershy和Marsha Chase分别用放射性同位素标记噬菌体,噬菌体转染实验,进一步证明遗传物质是DNA,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞
7、,32P 标记 DNA ,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,2.揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制,1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,Francis Crick & James Watson,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,1966年Nireberg等破译了全部64个遗传密码,3.遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,一、基因
8、工程诞生的理论基础 （二）技术上的三大发明 1.限制性核酸内切酶的发现与DNA切割,1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber 理论预见限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断,Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶,1978年Nobel生理或医学奖,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,2.DNA连接酶的发现与DNA片段的连接 1967年世界上5个实验室几乎同时发现DNA连接酶； 1970年Khorana实验室发现T4 DNA连接酶。 3.基因工程载体的研究与应用 1972年前后使用小分子量的细菌质粒
9、和噬菌体作载体。 在细菌细胞里的大量扩增。,理论上的三大发现： 证明了生物的遗传物质是DNA （基因工程的先导） DNA的双螺旋结构和半保留复制机理 遗传信息的传递方式（中心法则）,技术上的三大发现： 限制性内切酶的发现（标志着DNA重组时代的开始） DNA连接酶的发现 载体的使用,生物学院,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,二、基因工程的诞生 (一）Berg的开创性实验 1972年美国斯坦福大学Berg博士领导的研究组用EcoRI在体外对猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体DNA分别酶切，然后用T4 DNA连接酶将两种酶切片段连接，结果获得了SV40和噬菌体DNA的重组DNA分子，成功完成
10、了世界上第一次DNA体外重组实验，并因此与Gilbert、Sanger分享1980年度诺贝尔化学奖。,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,EcoRI recognition sites, phage DNA,EcoRI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,1972年第一个DNA重组分子产生,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,(二） Boyer-Cohen实验 1973年，Cohen等
11、人将编码Kan抗性基因质粒R6-5和编码Tet抗性基因质粒pSC101混合后，加入EcoRI进行酶切，用T4 DNA连接酶连接成重组DNA分子，最后转化大肠杆菌，结果某些转化菌落表现出既抗Kan又抗Tet的双重抗性特性。从这种双抗性转化菌落的大肠杆菌中分离出的重组质粒DNA带有完整pSC101分子和一个来自R6-5质粒编码Kan抗性基因DNA片段。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。,生物学院,基因工程的发展历程和理论基础,Boyer-Cohen实验,Stanley Cohen 1986 Nob
12、el生理或医学奖,Herb Boyer,R6-5,Tet,Kan,生物学院,基因工程的诞生与发展,三、基因工程的发展 (一）艰难阶段 主要关注安全性问题 (二）逐渐成熟阶段 1977年第一次实现基因在原核生物中的表达 (三）迅速发展阶段 20世纪80年代以后，高等动植物的遗传转化。,生物学院,基因工程的诞生与发展,发展过程中的重大事件： 1977年，E. coli中合成了人生长激素基因。 1978-1979年，胰岛素基因在大肠杆菌中表达。 1982年，培育出了超级鼠。 1985年，Horsch发明了植物基因工程的基本方法： 叶圆盘法，并获得转基因植株。 1990年，患有遗传免疫疾病的4岁女孩接
13、受了基因疗法。 1990年，Perlak 将B.T.基因导入棉花获得抗虫棉 。 1991年，美国开始人类基因组计划。 1997年，“多利”绵羊诞生。,生物学院,基因工程研究的主要内容,一、基因工程研究的主要内容 （一）基础研究 构建克隆载体及相应的表达系统、基因不同物种的基因组文库和cDNA文库、开发新的工具酶、基因工程新技术、新的操作方法。,生物学院,基因工程研究的主要内容,（二）克隆载体研究 基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的； Ti质粒的发现使植物基因工程研究迅速发展起来； 动物病毒克隆载体的构建，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节
14、。 构建适合于高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体是今后研究的重要内容。,生物学院,基因工程研究的主要内容,（三）受体系统的研究 基因工程的受体细胞与载体是一个系统的两个方面。受体是克隆载体的宿主，是外源目的基因复制和表达的场所。 受体：单细胞、组织、器官和个体均可以作为受体。 原核生物受体：E.coli 真核生物受体: 酵母是单细胞真核生物受体 植物受体：愈伤组织、细胞和原生质，部分组织和器官； 动物受体：生殖细胞和早期胚胎细胞作为基因工程受体； 人的体细胞也可以作为基因工程受体。,生物学院,基因工程研究的主要内容,（四）目的基因研究 基因工程研究的基本任务：开发人民需要的基因产物，这样
15、的基因叫做目的基因。 获得目的基因的方法：主要通过构建基因组文库或cDNA文 库，从中筛选出特殊需要的基因。 基因：医药相关的基因； 抗病、虫害和恶劣环境的基因； 特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。,生物学院,基因工程研究的主要内容,（五）生物基因组学研究 嗜血流感杆菌： 183 0137bp， 1743个基因 产甲烷球菌： 16 64976bp， 1682个基因 大肠杆菌K-12： 463 9221bp， 4288个基因 枯草杆菌： 4.21106bp, 4100个基因 1980年提出Human Genome Project (HGP)； 1990年开始，美国、英国、日本、德国、法国等国实施“
16、人类基因组计划”； 我国1999年9月获准参加这一计划，承担1%的测序任务。,生物学院,基因工程研究的主要内容,（六）应用研究,生物学院,基因工程研究的主要内容,光合作用 固氮作用 转基因植物 转基因动物 产生次生代谢产物,（六）应用研究 1.基因工程与农业,抗病虫 提高品质 提高花卉的观赏价值 抗逆性,生物学院,基因工程研究的主要内容,生物学院,无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻,基因工程研究的主要内容,生物学院,基因工程研究的主要内容,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,不会引起过敏的转基因大豆,生物学院,基因工程研究的主要内容,生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国),生物学院,基因工程研究的主要内容,乳汁中含有人生长激素的 转基因牛(阿根廷),生物学院,动物器官反应器：血液反应器和乳腺反应器
