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1、微专题突破 无菌操作技术实践一、微生物的分离与鉴定微生物的分离方法有很多种，本专题中常用的是：平板划线法、涂抹平板法、微生物的选择培养等。针对不同微生物的特点选择不同的方法，对目的微生物进行筛选。以下是尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与鉴定比较。项目尿素分解菌的分离与鉴定纤维素分解菌的分离与鉴定分离选择条件利用尿素为唯一氮源利用纤维素为唯一碳源鉴定方法培养基中加入酚红指示剂，变红色在以纤维素为唯一碳源的培养基上，利用刚果红染色法，出现透明圈鉴定原理细菌等微生物合成脲酶，将尿素分解产生NH3，使pH升高，加入酚红变红色分解纤维素的微生物产生纤维素酶，将纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使纤维素刚果红复
2、合物降解而出现透明圈步骤土壤取样制备培养基样品梯度稀释涂布平板培养观察进一步鉴定土壤取样制备培养基选择培养富集培养梯度稀释涂布培养刚果红染色法挑取菌落进一步鉴定二、纯化细菌的方法1倒平板与涂布平板法的操作(1)倒平板操作(2)涂布平板操作2两种纯化细菌的方法比较项目优点缺点适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较麻烦，平板不干燥，效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌三、影响植物组织培养过程的几种主要因素1培养材料不同的植物组织，培养的难易程度差别很大，容易进行无性繁殖的植物也容易进行组织培养。同一种植物
3、材料，材料的年龄、保存时间的长短对培养也有影响。幼龄、保存时间短的植物材料容易培养成功。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。2无菌条件培养基上有细菌等微生物存在时，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此在培养过程中要求进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。3植物激素在配制好的MS培养基中，常常需要添加植物激素。其中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。植物激素的浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，都会影响实验结果。1在进行分离分解尿素的细菌的实验时，甲同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同
4、学只筛选出大约50个菌落。某同学的实验结果产生的原因可能有()土样不同培养基污染操作失误没有设置对照ABC D【解析】某同学从培养基上筛选出的菌落较多，存在多种原因，如土样不同、培养基可能被杂菌污染或操作过程失误混入杂菌造成污染等。【答案】A2下列有关平板划线操作的说法正确的是()A使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌B打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞C将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可D最后将平板倒置，放入培养箱中培养【解析】在培养基上接种时，一定要做到无菌操作，以防止杂菌污染影响实验或研究的结果。在酒精灯火焰附近约10 cm的四周为无菌
5、区，因而含菌种试管和待接种试管管口不能离开火焰附近，接种环、棉塞也不能离开火焰附近。接种完毕之后为了防止菌体污染，保证安全，要用火焰灼烧管口和接种环，立即盖上皿盖。为防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，应将平板倒置。【答案】D3菊花的组织培养需要严格的无菌操作，下列说法不正确的是() 【导学号：67850018】A培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌B幼苗要先移植到消过毒的蛭石或者珍珠岩等环境下生活一段时间C用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，一旦感染杂菌则前功尽弃D将菊花茎段插入时应注意方向，不应倒插，是为了防止杂菌污染【解析】植物的组织培养需要严格的无菌操作，将菊花茎段插
6、入时，不应倒插是因为倒插的茎段不能形成愈伤组织，而不是为了防止杂菌污染。【答案】D4美国科学家斯图尔德应用植物组织培养技术，将二倍体胡萝卜韧皮部的一些细胞进行离体培养，最终发育成完整的新植株(如图)。关于这一 科学事实，下列叙述中错误的是() 【导学号：67850019】A该实验证明了植物细胞具有全能性B在此过程必须确保无菌操作C韧皮部细胞通过减数分裂增加数目D此种生殖产生的后代能保持亲本的性状【解析】该实验是利用胡萝卜的体细胞发育成完整的植株，因此体现了植物细胞的全能性；植物组织培养技术是一种无性繁殖方式，因此后代能保持亲本的性状；韧皮部细胞属于体细胞，体细胞依靠有丝分裂增加细胞的数目。【答
7、案】C5某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示，请分析回答下列问题：(1)培养基中加入化合物A的目的是_，这种培养基属于_培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是_。(3)在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是_。(4)转为固体培养基时，常采用平板划线法进行接种，此过程中所用的接种工具是_，操作时采用_灭菌的方法。(5)如何确认培养基是否合格？_。【解析】欲筛选可降解有机
8、物A的微生物，需配制只以有机物A为唯一碳源的选择培养基，以保障目的菌的生长，抑制非目的菌的生长繁殖；若需“振荡”培养，表明该目的菌为好氧型；平板划线接种的工具为接种环，使用前后均需灼烧灭菌。【答案】(1)筛选目的菌选择(2)化合物A异养需氧型(3)防止外来杂菌污染(4)接种环灼烧(5)不接种的空白培养基与接种培养基一起培养，用以证明培养基制备过程中是否被杂菌污染章末综合测评(一)(时间：45分钟，分值：100分)一、选择题(共8小题，每小题5分，共40分)1对无菌操作转接培养物的叙述中，正确的是()接种环在火焰上灼烧灭菌在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞打开棉塞的试管口通过火焰将已冷却的接种环伸入
9、菌液，蘸取一环菌液转移到一装有无菌培养基的试管中将试管口塞上棉塞接种环进行灭菌ABC D【解析】在无菌操作转接培养物的过程中，刚开始应灼烧接种环进行灭菌，在操作过程中应在酒精灯火焰旁进行，转接完成后还应对接种环进行灭菌，以防止培养物扩散到环境中。【答案】C2在农田土壤的表层自生固氮菌较多。将用表层土制成的稀泥浆接种到特制的培养基上培养，可将自生固氮菌与其他细菌分开，对培养基的要求是()加抗生素不加抗生素加氮素不加氮素加葡萄糖不加葡萄糖37 恒温箱中培养2830 温度下培养A BC D【解析】自生固氮菌有固氮功能，因此培养基中不需要加氮素；细菌对抗生素敏感，因此，不能加抗生素；自生固氮菌是异养型
10、的，应加葡萄糖；其生长繁殖的适宜温度是2830 。【答案】C3关于用涂布平板法培养和计数土壤中仅以尿素为氮源的微生物的实验，以下操作不正确的是()A需制备系列浓度梯度的土壤悬液B所选用的培养基中，尿素为唯一氮源C接种时从浓度最低的土壤悬液开始，每个浓度设置3个重复D涂布平板上形成的每个菌落，都是由样品中的单个个体形成的【解析】由于待测样品往往不易完全分散成单个个体，长成的菌落，也有可能来源于样品中的23个或更多个个体。【答案】D4某学者欲研究被石油污染过的土壤中的细菌数并从中筛选出能分解石油的细菌。下列有关操作错误的是() 【导学号：67850020】A利用平板划线法对细菌进行计数B利用以石油
11、为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌C采用涂布平板法分离菌种D称取土壤和稀释土壤溶液时应在火焰旁操作【解析】平板划线法能对细菌分离纯化但不能计数，通常将被石油污染过的土壤浸出液稀释后，采用涂布平板法分离分解石油的细菌菌种，并对菌种进行计数；筛选能分解石油的细菌只能利用以石油为唯一碳源的选择培养基；称取土壤和稀释土壤溶液过程中的每一步都要在火焰旁操作。【答案】A5下面为植物组织培养过程的示意图：对上图的下列叙述，错误的是()A将经脱分化培养成时，再植上人造种皮即可获得人造种子B植物组织培养所依据的生物学原理为细胞的全能性C过程指植物的营养生长和生殖生长阶段D的再分化过程中，诱导生根的激素为生长
12、素【解析】人工种子是由通过植物组织培养将离体的植物组织培养成的具有生根发芽能力的胚状结构包裹上人造种皮制成的，而不是由愈伤组织包上人造种皮形成的。【答案】A6用高度分化的植物器官、组织或细胞进行组织培养可以形成愈伤组织。下列叙述不正确的是()A该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B该愈伤组织的细胞没有全能性C该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成的D该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构【解析】植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。植物细胞只有在脱离了植物体，在一定的外部因素的作用下，细胞经脱分化和分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织分化形成胚状体或丛芽，从而形成新的植物体。【
13、答案】B7甲、乙、丙是三种微生物，下表、是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在中正常生长繁殖；甲能在中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在中正常生长繁殖，而甲和丙都不能。下列说法正确的是()培养基粉状硫10 gK2HPO44 gFeSO405 g蔗糖10 g(NH4)2SO404 gH2O100 mLMgSO4925 gCaCl205 g注：“”表示培养基中加入了这种物质，“”表示培养基中没有加入这种物质。A甲、乙、丙都是异养型微生物B甲、乙都是自养型微生物，丙是异养型微生物C甲是异养型微生物、乙是固氮微生物、丙是自养型微生物D甲是固氮微生物、乙是自养型微生物，丙是异养型微生物【解析】中缺少N，中缺少有机物，中营养全面。N是微生物生长的必需元素，每一种微生物正常生长都需要N，但自己能够固氮的微生物可以生活在无氮培养基中。甲能在中生长繁殖，而乙，丙都不以，说明甲是能够固氮的微生物。乙能在中生长繁殖，而甲、丙不能，说明乙不需要培养基为它的正常生命活动提供能源物质，则乙为自养型微生物，甲、丙都为异养型微生物。【答案】D8抗生素可由微生物产生，具有抑菌作用，能在琼脂培养基中扩散。在筛选产生抗生素的菌种时，先在琼脂培养基平板上划线接种一种从土壤中获得的甲菌，在27
